RNA干扰的抗病毒效应

天狼星

ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2003年11月15日;11(11):1769-1772
RNA干扰的抗病毒效应

李 宁, 范学工   

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李宁, 范学工, 中南大学湘雅医院传染科  湖南省长沙市  410008
项目负责人: 范学工, 410008, 湖南省长沙市, 中南大学湘雅医院传染科. [email protected]
电话: 0731-4327392    传真: 0731-4327332
收稿日期: 2003-05-14    接受日期:2003-06-02

摘要
双链RNA介导的RNA干扰(RNA interference， RNAi)能序列特异性的诱发转录后基因沉默，被认为是机体阻止外来病毒感染、保护细胞免受病毒入侵的一种细胞自我保护机制. 近年来研究表明，以病毒基因和宿主细胞受体分子为靶点，引入外源的小分子干扰RNA(siRNA)能显著性抑制病毒的复制与感染. RNAi作为一种抗病毒的有力武器，将给病毒性疾病的基因治疗带来新的希望.

李宁, 范学工. RNA干扰的抗病毒效应. 世界华人消化杂志  2003;11(11):1769-1772
http://www.wjgnet.com/1009-3079/11/1769.asp

0   引言
病毒性疾病是一类严重危害人类健康的疾病. 目前临床治疗这类疾病的措施主要是接种疫苗和以病毒特异性蛋白为靶点的药物治疗，这些药物并不能直接清除人体内的病毒，并且因其严重的毒副作用及耐药变种的出现，而限制了这些药物的临床应用. 为此，寻找新的抗病毒治疗方法成为当前临床工作中急需解决的重要问题. 近年发现的RNA干扰(RNA interference，RNAi)是动、植物抵御外来病毒感染、抑制病毒复制的一种重要细胞保护机制.体外实验表明，RNAi能特异、高效性地阻断病毒复制相关基因及宿主细胞受体基因的表达，以RNAi为手段的抗病毒基因治疗新近受到相关学者的极大关注.

1   RNAi的发现
RNAi现象最初是在转基因植物中发现的. 10 a前，在对牵牛花(Petunias)进行研究时发现，将色素合成基因置于一个强启动子后，导入牵牛花中，试图加深花朵的紫颜色，结果是不仅转入的基因未表达，而且自身色素合成也减弱了. 当时将这种现象称为转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)或“共抑制”(co-suppression)，并认为这是少数几种植物中的特殊现象，因为当人们将外源基因转入受体后，总是希望外源基因能高效表达，然而事与愿违的是，转基因导致的基因沉默广泛存在于植物、真菌、动物中. 这表明，转基因沉默并非偶然现象，而是普遍存在的一种基因调控机制.
        几年后，有学者用反义RNA阻遏华丽新小杆线虫(caenorhabditis elegans) par-1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA确能阻断par-1基因的表达，但奇怪的是，注入正义链RNA作为对照，同样也阻断了该基因的表达[1]. 接着，Fire及其同事首次将正义链和负义链的双链RNA(dsRNA)注入线虫，结果表现出比单独注射正义链或负义链都强得多的基因沉默. 实际上每个细胞只需少数几个dsRNA分子就能完全阻断同源基因的表达. 注入双链RNA不仅可以高效阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其下一代同源基因的沉默，Fire将这种现象称为RNAi[2]. RNAi代表了一种古老的PTGS通路，目前，RNAi 现象已经在很多生物体中被发现[3, 4]，比如植物、真菌、果蝇及包括小鼠在内的脊椎动物. 针对基因功能研究中的敲除技术，科学家将RNAi称为对靶基因的“knockdown”，这是一个在后基因组研究中可与“knockout”相媲美的技术. 2001年，RNAi技术被成功地引入到哺乳动物细胞基因功能的研究中，使其应用前景更为诱人[5, 6].

2   RNAi的作用机制
自从RNAi现象被发现后，其机制的研究就成为一个热点.在对线虫、果蝇进行大量研究后，产生了现有RNAi作用机制模型，该模型包括起始阶段和效应阶段[ 7-9]. 在起始阶段，导入的dsRNA被切割成21-23 nts的小分子干扰RNA(small interfering RNA， siRNA). 有证据表明，一个被称为Dicer的核酸内切酶能以ATP依赖的方式逐步切割由外源导入的双链RNA，将其降解为19-21nts的小片段，该片段具有5’-磷酸，3’-羟基和1-2个核苷酸的3’-粘性未端. Dicer 是Rnase Ш家族成员之一，在进化上相对保守，包括2个活性区域、1个RNA解旋酶活性区域及一个PAZ活性区域. 研究发现，重组人Dicer(re-hDicer)能体外切割dsRNA而生成有活性的siRNA，这表明Dicer参与了RNAi过程[10, 11 ]. 对大多数哺乳动物来说，长片段的dsRNA的引入可激活RNA依赖的蛋白激酶(RNA-dependant protein kinase， PKR)和2’，5’寡腺苷酸合成酶，而引起非特异性反应.PKR可通过一系列磷酸化使得翻译起始因子eIF-2α(initiation factor-2α)失活而导致RNA大范围、非特异性的翻译阻遏，而2’，5’寡腺苷酸合成酶可活化RNase L，进而非特异性降解RNA[12]. 随着研究的深入，人们逐渐认识到，在基因沉默发生过程中，大约21nts大小的siRNA直接起“干扰作用”，引入小片段的siRNA不仅能特异性的抑制同源基因的表达，而且也不会导致由PKR引起的非特异性反应[13-17]，这无疑会加快哺乳动物基因功能的研究，为疾病的基因治疗带来新的希望.
        在RNAi效应阶段，被Dicer加工成的siRNA与解旋酶、核酸酶等一起组成RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC). 此外，亦有文献[18]报道，来源细胞核的发夹(hairpin)RNA亦可经细胞内酶的作用后产生内源性siRNA，进而在胞质内形成RISC.RISC激活时需要解旋酶以ATP依赖方式将siRNA解开，激活的RISC通过碱基配对将反义链定位到同源的mRNA转录本上，引导核酸酶在距离siRNA 3’端12个碱基的位置切割mRNA. 研究表明，被切割的mRNA不产生任何中间产物，这提示RISC复合物中可能还含有核酸外切酶[19].
         RNA干扰至少具有以下几个重要特征: (1)高专一性.与靶mRNA之间一个碱基错配都会明显削弱基因沉默的效果. 不过并非所有符合条件的siRNA都同样有效，具体原因还不清楚，可能是位置效应(postitional effects)所致[20]. (2)高效性.实验表明，极少量的dsRNA分子就能完全抑制相应基因的表达，达到缺失突变体表型的程度，而仅凭几个dsRNA被Dicer切割成数十个siRNA并不能作出令人信服的解释，为此，有人提出随机降解PCR (random degradative PCR)模型.认为一种称之为RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，PdRP)以siRNA为引物扩增模板mRNA，产生的dsRNA供给Dicer，结果产生更多的siRNA[9, 21]. (3)传递性. RNAi具有很强的细胞穿透力，可以在不同细胞间传递和维持，甚至可以传至子代.

3   RNAi抗病毒效应的研究进展
转录后基因沉默作为植物细胞抗病毒的机制早已得到确认[22-27]，随着对RNAi现象的深入研究，人们发现动物细胞同样存在RNA干扰介导的抗病毒效应[28, 29].RNAi并被认为是机体阻止病毒复制、保护细胞免受病毒入侵的一种古老防御机制.动物细胞基因组中含有大量的病毒和转座子DNA，如何识别并抑制这些“非己”分子是机体面临的确重大挑战. 通常，导入的DNA由于甲基化而失活. 近年来研究表明，细胞为保护自身基因免受损害，如病毒入侵或转座子插入而采取基因沉默这一调节机制，目的是使入侵的外源基因失活，而不影响自身基因的表达，因此有学者称RNA干扰为基因组的“免疫系统”[9, 30]. 近年来，已有多个研究小组在植物病毒和动物病毒中发现并分离出能特异性抑制RNA干扰的某些抑制因子[28, 31-35]，这一发现有力说明了RNAi是机体自然的抗病毒防御机制，对RNAi的抑制是病毒对宿主细胞抗病毒感染的一种适应. 尽管RNA干扰抗病毒的精确机制尚不清楚，研究表明，在小鼠和人的细胞中，直接转入siRNA，产生了具有序列特异性的抗病毒效应，其过程并不激活PKR及RNase L酶.
        HIV-1是一种RNA逆转录病毒，其生活周期特殊而复杂.病毒包膜糖蛋白gp120与宿主细胞膜上的CD4抗原作用，引起gp120构象改变，使之适合与协同受体结合，gp120-gp41复合物构象的进一步改变导致gp41介导的病毒与细胞膜间的融合，病毒衣壳分解，RNA进入细胞质内. 随后，RNA被逆转录为cDNA，在整合酶的作用下，cDNA整合至宿主细胞DNA上，形成前病毒. 当病毒获得活化信号时，其DNA转录RNA，经过修饰与翻译，成熟的子代被装配和释放出来. HIV-1生活周期早期阶段和晚期阶段，均可成为siRNA作用的靶点. siRNA一旦进入细胞，其作用就如同药物，能特异性地阻止病毒继续感染. 新近几个研究小组将不同siRNA小片段体外引入细胞中，发现与siRNA同源的靶基因不同程度地被降解，同时，HIV的复制受到抑制，表现出HIV-1 p24的产量显著下降. 除HIV-1本身的结构与调节基因外，与病毒复制有关的宿主细胞受体分子如CD4，CCR5亦可成为RNAi的靶点(表1).

表1   HIV-1复制相关靶点siRNA的抗病毒效应

靶基因 方法 RNAi效应
gag [36] 体外合成21 nts的p24  siRNA， 转染细胞 p24蛋白合成降低，HIV复制抑制率提高
tat [37] 体外合成21 nts的p24  siRNA， 转染细胞 抑制靶基因的表达与HIV的复制
rev [38] 构建特异性表达靶基因的细胞内表达载体 较长时间地抑制HIV复制，多位点的联合作用显著提高抗HIV效率
CD4 [36] 体外化学合成21 nts siRNA，转染细胞 CD4表达下降8倍，HIV感染率降低
CCR5(CXCR4) [39] 体外化学合成21 nts siRNA，转染细胞 选择性下调靶基因表达，抑制病毒对细胞的感染
vif [40] A: 设计不同位点的siRNA，化学合成 HIV复制受抑制， 单碱基的错配便降低抗病毒效应
B: 构建能表达茎环发夹结构siRNA表达载体 HIV复制下降20-30倍

         丙型肝炎病毒(HCV)是导致慢性肝病和肝细胞癌的一个主要致病因子，其基因组为单链正股RNA，长约9.5 kb，编码一条约含3 000个氨基酸的多聚蛋白前体，此蛋白前体经酶切加工成结构蛋白和非结构蛋白.结构蛋白组成病毒的核衣壳和包膜，非结构蛋白参与病毒的复制. 体外细胞培养不能稳定繁殖HCV，近年来有学者将含有HCV 基因组全序列或部分序列的质粒转染传代细胞株(Huh-7)，构建了能稳定表达HCV RNA的细胞模型，为进一步研究病毒的复制及其蛋白功能等提供了条件[41-45]. Randall et al [46]以NS5B为靶点化学合成siRNA并转染Huh-7细胞，发现HCV RNA表达竟下降80倍. Kapadia et al [47]以非结构区为靶点构建了7个siRNA表达质粒，转染Huh-7后，运用实时RT-PCR分析发现NS3 siRNA和NS5B siRNA分别使同源的病毒基因表达下调21倍和23倍，从而有效抑制病毒的复制，此研究小组进一步发现这种抑制作用并不涉及IFN途径. 此外，亦有其他学者对siRNA的抗HCV效应进行了研究，均取得了明显的靶基因沉默效果[48, 49]. 新近Shlomai et al [50]以乙型肝炎(HBV)X区和核心区为靶点，构建siRNA表达质粒pSUPER x和pSUPER core，将质粒分别导入HBV感染细胞后，发现能显著而特异性降低X蛋白和核心蛋白的表达水平. 这些结果表明，作为抗病毒的有力武器，RNAi能胜任多种病毒的基因治疗.

4   问题与展望
诸多研究表明，RNAi作为新发现的抗病毒方法，在抗病毒感染与复制过程中发挥了重要作用，但RNAi最后要成为临床治疗的一种有效手段仍需要解决一些问题. (1)并不是所有病毒mRNA都易被siRNA识别并结合，一些mRNA的识别靶点因其二级结构或高度折叠而被遮盖了; 另外，一些mRNA可能和别的蛋白形成复杂的复合物而隐藏了其siRNA的识别位点. (2)有报道称，mRNA与siRNA间单个碱基的错配便能降低基因沉默效率[40]，而病毒在逃避免疫监视或药物的抑制时，会产生大量的变异体，这样给siRNA序列的设计带来困难，为此，必须选择不同种系间转录序列高度保守的同源序列作为靶点. 另外，选择宿主细胞膜上的受体或协同受体作为靶点也不失为一种有效的方法. CCR5结构上较为保守，单个碱基的改变并不影响其免疫功能，而被看作是抗HIV基因治疗较为理想的靶点[39]. 此外，有学者[30]提出以联合多个靶点的siRNA诱导基因沉默的方法来治疗AIDS，即高效抗逆转录病毒基因沉默疗法(highly active anti-retroviral gene silencing， HAAGS). (3)siRNA稳定性的问题. 体外合成siRNA虽然简单，但导入的siRNA易被RNase降解，且转染以瞬时表达为主.构建能在细胞内稳定表达的载体被认为是一种较理想的方法. Brummelkamp et al [51]构建了一个能在哺乳动物细胞(MCF-7)中表达的载体pSUPER，此载体含有转录RNA的起动子Pol-III H1，其特点是转录后该RNA能折叠形成茎环结构，并且经修饰后能在3’端形成两个尿苷酸(U)的突出. 实验表明该载体能有效表达siRNA，介导十多个基因的“knockdown”，而且不产生任何细胞毒性作用. 此外，含有U6启动子的siRNA表达载体也见于多篇文献报道[15, 18, 52]. 这种载体可含1-2个启动子，并且在正义链与反义链间有UUCG 4个碱基连接. 转录后两段RNA在细胞内形成siRNA. Lee et al [38]运用此载体表达 rev siRNA，取得了很好的抗病毒效果. Sui et al [16]报道的方法与此类似，不同的是siRNA模板为回文结构，在U6启动子下游依次是siRNA编码序列、6 nts的间隔序列、反向siRNA编码序列以及5个T的终止序列.在细胞内，该质粒可转录出一个含发夹结构的siRNA.最近，有几个研究小组尝试用病毒如腺病毒、逆转录病毒作为载体，将siRNA引入细胞，取得了很好的基因沉默效果[53, 54].
       15 a前，针对HIV感染的抗病毒治疗，Batltimore et al [55]提出“细胞内免疫(intracellular immunization)”的概念，预见今后细胞可通过产生某些抑制分子来阻止病毒的感染与复制. siRNA的发现为这种预见带来可能.如今，除HIV和肝炎病毒外，RNAi作为一种抗病毒感染的有力武器已成功地应用于其他病毒，如脊髓灰质病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒等研究中[56-61]，为这些感染性疾病的基因治疗开辟了新的途径.

5     参考文献 略

life

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[B]How does RNAi work?  [/B] Genetic and biochemical data indicate a possible two-step mechanism for RNA interference (RNAi): an initiation step and an effector step. a | In the first step, input double-stranded (ds) RNA is processed into 21–23-nucleotide 'guide sequences'. Whether they are single- or double-stranded remains an open question. An RNA amplification step (shaded box) has been suggested on the basis of the unusual properties of the interference phenomenon in whole animals, but this has not been reproduced definitively in vitro. b | The guide RNAs are incorporated into a nuclease complex, called the RNA-induced silencing complex (RISC), which acts in the second effector step to destroy mRNAs that are recognized by the guide RNAs through base-pairing interactions.
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遗传和生化数据表明RNAi作用机理可能分为两步：起始步骤和作用步骤。在第一步中，输入细胞内的双链DNA被加工成21－23核苷酸的“引导序列”，这些引导序列是单链还是双链现在还不清楚。RNA扩增步骤（阴影部分）有可能是普遍存在于所有动物中的一种基本干扰现象，但这一推测还没有在体外得到证实。
b，引导序列掺入到核酶复合物中（即RNA诱导的沉默复合物，RISC），RISC在第二步作用步骤中破坏引导序列通过碱基配对识别的mRNA.