HBsAg疫苗对非溶细胞性和溶细胞性细胞免疫应答的影响

天狼星

ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2003年11月15日;11(11):1802-1804 HBsAg疫苗对非溶细胞性和溶细胞性细胞免疫应答的影响 熊一力, 贾彦征, 施 理, 张宜俊 -------------------------------------------------------------------------------- 熊一力, 贾彦征, 施理, 张宜俊, 中国人民解放军第458医院全军传染病中心 广东省广州市 510602 项目负责人: 熊一力, 510602, 广州市东风东路801号, 中国人民解放军第458医院全军传染病中心. [email protected] 电话: 020-87373156 传真: 020-87371180 收稿日期: 2002-11-12 接受日期: 2002-12-05 摘要 目的: 观察HBsAg 疫苗对细胞免疫应答的影响及其诱生的免疫反应类型. 方法: 低、中、高剂量HBsAg疫苗两次免疫小鼠后，采用酶联免疫法检测鼠血清抗HBs IgG2a，并用乳酸脱氢酶分析法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤靶细胞的活性. 结果: HBsAg疫苗可诱导小鼠产生抗HBs IgG2a，中、高剂量组阳转率(91.1 %、100 %)显著高于低剂量组(62.5 %)，P均<0.01; 低、中、高剂量组部分鼠特异性CTL释放率大于60 %，达到特异性CTL活化(60 %、60 %、56 %)，与对照组(0 %)比较P均<0.01 结论: HBsAg疫苗可增强特异性细胞免疫反应，而且对非溶细胞性和溶细胞性免疫应答均可上调. 熊一力, 贾彦征, 施理, 张宜俊. HBsAg疫苗对非溶细胞性和溶细胞性细胞免疫应答的影响. 世界华人消化杂志 2003;11(11):1802-1804 http://www.wjgnet.com/1009-3079/11/1802.asp 0 引言 近年将HBsAg疫苗作为治疗性疫苗治疗慢性乙型肝炎(CHB)已有一些令人鼓舞的报道[1, 8]，但其作用机制是否与纠正CHB细胞免疫应答低下有关及究竟是调节非溶细胞性还是溶细胞性免疫应答或二者皆有还有待证实.本研究用HBsAg疫苗免疫正常小鼠后，测定了不同剂量疫苗对实验鼠抗HBs IgG2a产生和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能的影响，以观察HBsAg疫苗对细胞免疫应答的影响及其诱生的免疫反应类型. 旨在探讨HBsAg疫苗治疗CHB的作用机制. 1 材料和方法 1.1 材料 实验药品用重组(酵母)乙型肝炎疫苗(recombinant hepatitis B vaccine (yeast)，RHBV)，每支1 mL，主要含重组(酵母)HBsAg亚单位60 mg，溶剂均用铝稀释剂0.5 mg/mL (康泰生物制品有限公司产品).实验动物用6-8周龄的SPF级别BALB/C小鼠，雌雄各半，体重16-18 g (购自华中科技大学同济医院实验动物部). 主要试剂和仪器有乙型肝炎表面抗体检测试剂盒(上海实业科华生物技术公司)，HRP标记羊抗鼠IgG2a (Serotec公司)，特异性HBsAg-T细胞表位短肽(赛百盛生物工程公司)，P815细胞(中科院上海细胞所)，乳酸脱氢酶检测试剂盒(Sigma公司)，全自动酶标仪550型(Bio-RAD公司). 1.2 方法 1.2.1 分组和给药方法 将小鼠随机分为以下4组，分别在0、4 wk于右后肢肌肉注射给药，用药6 wk时采血，处死、检测.空白对照组: 注射同量生理盐水; RHBV低剂量组: 注射RHBV 30 mg/kg (0.5 mg/只)/次; RHBV中剂量组: 注射RHBV 90 mg/kg (1.5 mg/只)/次; RHBV高剂量组: 注射RHBV 270 mg/kg (4.5 mg/只)/次. 1.2.2 检测方法 (1)抗HBs IgG2a检测采用酶联免疫法先将小鼠待测上清加入96孔培养板，50 mL/孔(空白孔不加)，37 °C 30 min洗板5次后，每孔加入1:4 000 HRP标记的羊抗小鼠IgG2a，37 °C 30 min，再洗板5次后加显色剂，用酶标仪读各孔A值. 以空白对照作为阴性对照，样品A值/阴性对照A平均值大于或等于2.1判为阳性，阴性对照A值<0.05按0.05计算，高于0.05按实际A值计算. (2)CTL功能检测采用乳酸脱氢酶(LDH)分析法[9] 取小鼠脾淋巴细胞，用含5mg/mL特异性短肽的1 640培养基培养，第2 d加IL-2 1000 U/mL、ConA 5 mg/mL. 至淋巴细胞成簇生长，有多个核淋巴细胞时，收集、计数、调整细胞数至106/mL，作为CTL反应的效应细胞.胰酶消化对数生长期的P815细胞，用含10 mg/mL短肽的1 640培养液悬浮P815细胞，培养过夜. 加丝裂霉素至25 mg/mL，孵育45 min，用1 640培养基洗涤4次后观察.若细胞成活率在95 %以上，调整细胞数至104/mL，作为CTL反应的靶细胞. 按效应细胞:靶细胞1 000:1比例，加入96孔细胞培养板，并补加1 640培养基至100 ml ，同时设靶细胞的最大释放孔: 以100 mL/L Tritong X-100代替效应细胞; 自然释放孔: 以1 640代替效应细胞; 培养基本底: 只含100 mL培养基; 校正本底: 含100 mL培养基及100 ml/L的Tritong X-100. 每个样本设3个重复孔. 4 h后观察靶细胞，若最大释放孔靶细胞未完全破坏，再加Tritong X-100-200 mL/L，待靶细胞完全破坏，200 g离心2 min，吸出上清，与LDH反应液反应20 min后，加入终止液，在酶标仪492波长上读取每孔A值，检出特异性CTL活化过程中LDH释放量. 按下式计算特异CTL释放率: 自然释放: 自然释放-培养基的本底; 最大释放: 最大释放-校正本底; 自然释放率: 自然释放/最大释放; 最大释放率: 最大释放/培养基本底; 校正率最大: 最大释放/校正本底; 特异CTL释放率: (试验-自然释放-培养基的本底)/(最大释放-自然释放).计算特异CTL释放率，大于60 %者为有特异性CTL活化. 统计学处理 特异性CTL活化鼠数量组间差别用x2检验和Fisher’s确切概率法检验. 2 结果 RHBV免疫可诱导小鼠产生抗HBs亚类IgG2a，中、高剂量组阳转率显著高于低剂量组(P <0.01)，RHBV各剂量组部分鼠特异性CTL释放率大于60 %，达到特异性CTL活化(P <0.01)，高剂量组用药4wk时，死亡1只鼠，原因不明(表1). 表1 不同剂量RHBV免疫小鼠6wk时对抗HBs IgG2a产生和CTL活化的影响(%) 分组 n (只) 抗HBs IgG2a阳转率 n (只) 特异性TCL活化鼠量 空白对照组 24 0 (0/24) 10 0 (0/10) RHBV低剂量组 24 62.5 (15/24) 10 60 (6/10)b RHBV中剂量组 24 91.1 (22/24)a 10 60 (6/10)b RHBV高剂量组 24 100 (24/24)a 9 56 (5/9)b aP <0.01vs低剂量组, bP <0.01vs空白对照组. 3 讨论 慢性HBV感染主要由宿主细胞免疫功能低下，对HBV产生不同程度免疫耐受造成[10-11]. 虽然已有一些抗HBV药物，但HBV的最终清除要依靠机体的免疫力，因而寻找对HBV特异性的免疫调节剂和特异性主动免疫疗法是治疗本病的重要环节[12-13]. 目前研制的乙型肝炎免疫调节剂主要有HBsAg疫苗、HBsAg/前S2疫苗、HBsAg复合疫苗和HBV DNA疫苗等，这些疫苗多以HBsAg为主要免疫原[14-20]. 近年国外已有将大剂量HBsAg疫苗免疫人和动物后产生较理想直接或间接抗HBV作用的报道[21-22].但该作用是否与增强机体特异性细胞免疫应答相关，是否涉及溶细胞和非溶细胞免疫途径，尚不清楚.所以本实验从不同剂量RHBV免疫对小鼠抗HBs IgG2a产生(代表非溶细胞性细胞免疫)和CTL功能(代表溶细胞性细胞免疫)的影响着手，探讨HBsAg疫苗可能的作用机制. 本结果中HBsAg疫苗诱导小鼠产生抗HBs IgG2a，使特异性CTL活化，且呈一定量效关系，说明一定剂量的HBsAg有增强机体特异性细胞免疫应答的作用，此结果与我们的另一项实验中HBsAg促进T淋巴细胞增生，诱生IL-2、IFN-g-证明上调细胞免疫反应的结果(待发表)基本一致. 而且本结果还表明HBsAg疫苗既可上调非溶细胞性细胞免疫，也可上调溶细胞性细胞免疫. 现已认识到HBV感染后首先由功能最强的抗原呈递细胞-树突状细胞(dendritic cell，DC)将HBV抗原呈递给T淋巴细胞，并以双信号(抗原和协同刺激分子)特异激活T细胞.活化的特异T细胞则通过非溶细胞性免疫应答(分泌细胞因子IL-2、IFN-g、IFN-a，促进抗HBs IgG2a产生)和溶细胞性免疫应答(特异性CTL杀伤感染HBV的肝靶细胞)来清除HBV[23-24]. 已有研究证明: HBV慢性感染者DC呈递HBV抗原的能力低下，使T细胞活化增生受限，产生细胞因子等免疫活性物质减少，特异性CTL反应减弱，造成对HBV无应答或低应答[25-28]. 由此看，HBsAg疫苗诱导抗HBs IgG2a和使特异性CTL活化代表HBsAg增强了非溶细胞和溶细胞性特异免疫应答，应会促进HBV清除，对治疗CHB应该有利. HBsAg诱生细胞免疫应答的作用点何在呢？可能是外周组织注射一定量的外源性HBsAg时，可在局部形成足够的免疫原刺激，使较多的DC(主要分布在外周组织)被激活，相继诱导出一系列的细胞免疫应答. 如此分析DC功能较好的个体可能会彻底清除HBV，而DC功能较低下者，可能让HBV免疫逃避形成免疫耐受，所以HBsAg对不同个体可能会疗效不一. 多年来，CTL通过穿孔素或FasL-Fas机制杀伤感染HBV的靶细胞一直被认为是CTL清除HBV的主要机制.近年发现，活化的CTL也可分泌多种细胞因子(IFN-g、IFN-a等)，通过非溶细胞途径清除病毒，且此途径可能是感染早期清除HBV的主要机制[29-30]. 因而HBsAg激活的特异性CTL不一定仅与溶细胞免疫有关，可能是通过非溶细胞和溶细胞两条途径联合清除HBV.当然，这些推测都还有待进一步阐明. 4 参考文献 略