丙型肝炎病毒母婴传播及羊水、乳汁和唾液的作用

天狼星

ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2003年11月15日;11(11):1822-1824 丙型肝炎病毒母婴传播及羊水、乳汁和唾液的作用 王占英, 牛美智, 鲁学恒, 李 颖, 乔光彦 -------------------------------------------------------------------------------- 王占英, 李颖, 乔光彦, 中国医科大学附属二院感染科 辽宁省沈阳市 110004 牛美智, 沈阳市中国人民解放军第四人民医院内科 辽宁省沈阳市 110031 鲁学恒, 沈阳铁路分局沈北医院内科 辽宁省沈阳市 110013 沈阳市科委资助课题, No. 9540 项目负责人: 王占英, 110004, 辽宁省沈阳市和平区三好街36号, 中国医科大学附属二院感染科. [email protected] 电话: 024-83956961 收稿日期: 2003-03-07 接受日期: 2003-03-25 摘要 目的: 研究丙型肝炎病毒(HCV)母婴传播及羊水、乳汁和唾液在母婴传播中的作用. 方法: 用酶免疫测定(EIA)检测IgG抗-HCV; 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HCV-RNA; Taq DNA聚合酶循环测序法对PCR产物测序. 结果: 抗-HCV和HCV-RNA均阳性孕妇的24例婴儿中有4例血清检出HCV-RNA，阳性率为16.7 %; 一对HCV-RNA均阳性母、婴的HCV-cDNA序列同源性为100 %; 母亲羊水、乳汁和唾液HCV-RNA阳性率分别为25 %、16.7 %和0 %; 3例羊水HCV-RNA阳性母亲的婴儿有2例HCV-RNA阳性(66.7 %). 结论: 母婴传播是婴幼儿感染HCV的重要途径，传播率为16.7 %. 羊水在HCV母婴传播中起重要作用. 王占英, 牛美智, 鲁学恒, 李颖, 乔光彦. 丙型肝炎病毒母婴传播及羊水、乳汁和唾液的作用. 世界华人消化杂志 2003;11(11):1822-1824 http://www.wjgnet.com/1009-3079/11/1822.asp 0 引言 丙型肝炎病毒(HCV)主要经输血注射传播[1]. 然而母婴传播也是HCV的重要传播途径，但国内外报告其传播率差异较大. HCV 可在宫内或分娩时感染婴儿，但羊水、乳汁和唾液在HCV母婴传播中的作用尚不清楚. 我们于1996-01/2000-01筛查4 233例妊娠晚期孕妇，对其中24例抗-HCV及HCV-RNA均阳性的孕妇进行母婴传播研究，并检测母亲羊水、乳汁和唾液的HCV-RNA，以揭示三种体液在母婴传播中的作用. 1 材料和方法 1.1 材料 1996-01/2000-01在中国医科大学附属第二医院和沈阳市妇婴医院妇产科门诊对4 233例妊娠晚期妇女筛查血清抗-HCV，检测肝功能，部分血清-30 °C保存备检HCV-RNA，其中抗-HCV阳性孕妇46例，32例接受本研究. 其中24例血清HCV-RNA阳性，16例有手术、输血及输血液制品史; 有4例为慢性丙型肝炎; 其余20例为病毒携带者，产前检查肝功能均正常. 对32例血清抗-HCV阳性孕妇所生子女定期随访1 a，在出生后1 wk内、3 mo、6 mo、9 mo和12 mo分别采血检测抗-HCV、HCV-RNA和ALT. 采血后1 h内分离血清，立即-30 °C保存. 采集15例抗-HCV阳性母亲的羊水各2 mL，乳汁和唾液各5 mL. 羊水用无菌注射器抽取，唾液于清晨刷牙潄口前采集. 乳汁1 000 r/min离心20 min去脂质层，羊水和唾液10 000r/min离心5 min取上清，-70 °C保存. 乳汁HCV-RNA提取前10 000 r/min离心5 min取上清. 所有容器均经高压灭菌处理. 选择10例抗-HCV及HCV-RNA均阴性孕妇的婴儿作为对照. 1.2 方法 1.2.1 抗-HCV检测 IgG抗-HCV用第三代抗-HCV EIA检测，试剂盒由上海荣盛生物科技公司提供(批号 991001)，检测及结果判定均严格按试剂说明书进行. 1.2.2 HCV-RNA检测 RNA提取参考文献方法[2]. 逆转录和PCR按文献方法[3]. PCR结束后，取15 ?L样品加在含0.5 mg/mL EB的20 g/L琼脂糖胶电泳，紫外检测仪观察结果. 第二次PCR扩增片段为145 bp. 每次实验均设阳性、阴性及空白对照，且每份样本重复2次，结果一致者判为阳性. 引物参考文献[4]，利用高度保守的HCV 5’非编码区序列由中国科学院上海细胞生物研究所合成. 外引物正、负链分别为5’-ACT CCA CCA TAG ATC ACT CC-3’和5’-AAC ACT ACT CGG CTA GCA GT-3’; 内引物正、负链分别为5’-TTC ACG CAG AAA GCG TCT AG-3’和5’-GTT GAT CCA AGA AAG GAC CC-3’. 1.2.3 PCR产物测序 PCR产物纯化试剂盒和荧光标记终止物测序试剂盒均由PE公司提供，用Taq DNA聚合酶循环测序法测序. (1)测序引物为5’-TTC ACG CAG AAA GCG TCT AG-3’. (2) 4种dNTP/ddNTP混合物每种各取2 mL，分别加入4个微量离心管中，每管中dNTP浓度均为30 mmol/L，而每种dNTP相应ddNTP浓度分别为: ddATP 1.2 mmol/L，ddTTP 1.2 mmol/L，ddGTP 0.09 mmol/L， ddCTP 0.6 mmol/L. (3) HCV-cDNA测序模板的纯化按试剂说明书进行，将HCV-cDNA片段与PCR反应剩余的dNTP及引物分离后，加入测序引物、测序缓冲液和Taq DNA聚合酶(用量按试剂盒说明书). (4)上述步骤 (3)的混合物各取4 mL，加入步骤(2)的4管dNTP/ddNTP中进行循环测序. (5) 取3 mL测序反应物加入测序凝胶(60 g/L丙烯酰胺)上样孔内电泳，通过自动测序仪读出核苷酸序列. 2 结果 2.1 婴儿抗-HCV和ALT检测结果 抗-HCV阳性母亲的32例婴儿出生时血清抗-HCV阳性率100 %，3 mo为78.1 %，6 mo为18.8%，只有2例持续性HCV血症的婴儿生后9 mo和12 mo时抗-HCV仍然阳性. 所有婴儿血清ALT全部正常.对照组母亲的10例婴儿，抗-HCV均阴性. 2.2 婴儿HCV-RNA检测结果 HCV-RNA阳性孕妇的24例婴儿中有4例血清检出HCV-RNA，阳性率为16.7 %. 2例出生时，6 mo和12 mo时HCV-RNA均阳性，另2例仅在出生时检出HCV-RNA，生后6 mo和12 mo时复查均阴性. HCV-RNA阴性母亲的8例婴儿HCV-RNA均阴性. 对照组10例婴儿未检出HCV-RNA. 2.3 HCV-cDNA序列测定 选择1例婴儿血清HCV-RNA持续阳性者，对母、婴HCV-cDNA进行序列测定，母、婴间HCV-cDNA序列(46-190 nt)完全相同，同源性为100 %. 2.4 孕妇体液抗-HCV及HCV-RNA的检测 15例抗-HCV阳性母亲羊水、乳汁和唾液抗-HCV和HCV-RNA检测结果见表1. 3例羊水HCV-RNA阳性母亲的婴儿有2例血清HCV-RNA阳性(66.7 %)，而羊水HCV-RNA阴性母亲的婴儿HCV-RNA均阴性，二者间有非常显著的统计学差异(x2=7.2，P <0.01). 表1 孕妇体液抗-HCV和HCV-RNA检测 体液 抗-HCV HCV-RNA n 阳性数(%) n 阳性数(%) 羊水 15 15 (100)a 12 3 (25.0) 乳汁 15 8 (53.5)a 12 2 (16.7) 唾液 15 15 (100)a 12 0 (0) 乳汁抗-HCV阳性率显著低于羊水和唾液(x2=6.71, aP <0.01). 3 讨论 3.1 HCV母婴传播率 近年来国内外学者报告未合并HIV感染孕妇的婴儿HCV感染率为2.7-15.0 %[5-9]. 本文结果表明24例HCV-RNA阳性的母亲所生婴儿中有4例出生后血清HCV-RNA阳性，2例HCV-RNA持续存在. 其中1例母婴间HCV-cDNA相应片段序列同源性为100 %，提示该婴儿HCV感染由其母亲传播. 本文HCV母婴传播率为16.7 % (4/24). 本文结果进一步证实母婴传播是HCV的重要传播途径之一. 3.2 HCV母婴传播的标志 抗-HCV作为人体感染HCV的间接证据，一直作为HCV血清流行病学调查的主要指标. 但近年来研究[3]证实孕妇的IgG抗-HCV可以通过胎盘到达婴儿体内，婴儿出生后血中IgG抗-HCV短期存在(大多数在6 mo内消失)不能认为婴儿已感染HCV. 本文结果支持这一观点，抗-HCV阳性母亲的32 例婴儿出生时IgG抗-HCV全部阳性，6 mo时80 %以上的婴儿抗-HCV已消失. 但2例持续HCV血症者抗-HCV持续存在超过12 mo，故抗-HCV持续较长时间或主动产生可能提示婴儿已感染HCV[9, 10]. HCV-RNA是病毒存在和复制的直接指标，是确诊HCV感染的直接证据，故可作为判定母婴传播的标志. 3.3 HCV母婴传播感染方式 本文4 例HCV感染婴儿均在出生后1 wk内血清HCV-RNA即阳性，其中2例在随访期间(6 mo时)血清HCV-RNA阴转，另2例血清HCV-RNA持续存在，并排除了与HCV感染有关的其他暴露因素，表明其传播方式可能为宫内或分娩时感染，与Steininger et al [11]的研究结果一致. HCV感染孕妇引产胎肝HCV-RNA阳性证明宫内传播的存在[3, 12]. 本文3例羊水HCV-RNA阳性母亲的婴儿有2例感染HCV，提示HCV污染的羊水在母婴传播中起重要作用. 本文12例血清HCV-RNA阳性孕妇有2例乳汁中检出HCV-RNA(16.7 %)，血清HCV-RNA 阳性母亲的婴儿中有18例母乳喂养，除2例出生时即HCV-RNA阳性外，其余16例HCV-RNA均阴性，故不提示母乳引起HCV传播，与Tajiri et al [13]研究结果一致. 但Ruiz-Extremera et al [14] 认为HCV-RNA阳性乳汁有传染性，应避免母乳喂养. 本文12例血清HCV-RNA阳性孕妇唾液均未检出HCV-RNA，与葛向华 et al [15]研究结果一致，故认为唾液传播HCV的可能性较小. 4 参考文献 1 Alter MJ. Hepatitis C virus infection in the United States. J Hepatol 1999;31(Suppl 1):88-91 2 Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA Isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987;162:156-159 3 王占英, 王永来, 李颖, 吴海滨, 李娜, 乔光彦, 刘庆成. 丙型肝炎病毒母婴垂直传播的研究. 中国公共卫生 1997;13:136-137 4 Kanai K, Iwata K, Nakao K, Kako M, Okamoto H. 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Acta Obstet Gynecol Scand 2003;82:229-234 10 Nordbo SA, Johansen OJ, Brubakk AM, Bakke K. Vertical transmission of hepatitis C virus in Sor-Trondelag. Tidsskr Nor Laegeforen 2002;122:1977-1980 11 Steininger C, Kundi M, Jatzko G, Kiss H, Lischka A, Holzmann H. Increased risk of mother-to-infant transmission of hepatitis C virus by intrapartum infantile exposure to maternal blood. J Infect Dis 2003;187:345-351 12 沃健儿, 陈智, 刘克洲, 何南祥, 徐陈槐, 章明太. HCV感染孕妇的引产胎肝内HCV-RNA的定位研究. 中华传染病杂志 1996;14:218-219 13 Tajiri H, Miyoshi Y, Funada S, Etani Y, Abe J, Onodera T, Goto M, Funato M, Ida S, Noda C, Nakayama M, Okada S. Prospective study of mother-to-infant transmission of hepatitis C virus. Pediatr Infect Dis J 2001;20:10-14 14 Ruiz-Extremera A, Salmeron J, Torres C, De Rueda PM, Gimenez F, Robles C, Miranda MT. Follow-up of transmission of hepatitis C to babies of human immunodeficiency virus-negative women: the role of breast-feeding in transmission. 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