肝干细胞的研究进展及应用前景-->清照添加

守护天使

肝干细胞的研究进展及应用前景  
  
肝卵圆细胞 (hepatic oval cell, HOC)，在体内可分化为肝细胞或胆管上皮细胞。 目前HOC的分离和培养技术及干细胞移植技术已为肝病治疗带来希望。本文主要就肝干细胞及其临床应用的最新研究进展作一综述。

肝干细胞(hepatic stem cell,HSC) 来源于前肠内胚层，在胚胎发育过程中，以肝细胞的形式存在，在成年哺乳类动物肝脏中，以小卵圆形细胞的形式存在于终末小胆管 (Hering管)，又称肝卵圆细胞 (hepatic oval cell, HOC) 或肝前体细胞，其特点是胞体小，核大而胞质少，呈卵圆形并具有特殊的表面标志。这种细胞以往被认为是“小上皮细胞”、“胆管反应”和“胆小管”。HOC具有双向分化增殖潜力，可分化为肝细胞或胆管上皮细胞。在分化为成熟肝细胞前，HOC先分化为嗜碱性小肝细胞即过渡肝细胞。随着HOC分离和培养技术的成熟，肝干细胞工程将成为一个新兴的肝细胞移植研究领域，为肝病患者的治疗带来新的福音。本文就肝干细胞及其临床应用的最新研究进展作一综述。

1.HOC及其分化

根据细胞的形态和分布部位可将HOC分为4型：0型，位于肝内胆管系统，具有典型干细胞的形态特征，细胞无极性，核大，染色质形态多变，边集，缺乏高尔基体、线粒体和溶酶体等功能细胞器，无任何分化的细胞表面标志，又称肝干细胞；I型，位于肝血窦或肝索内，卵圆形，核呈圆或卵圆形，胞质中含中等量的细胞器和少量张力丝，又称未成熟肝前体细胞；II型，主要位于胆管上皮中，具有一些胆管细胞特有的结构特征，又称胆管样卵圆细胞；III型，位于肝窦或肝索内，呈卵圆形，有一个圆或卵圆形的细胞核，胞质中有溶酶体和高尔基体，又称肝细胞样卵圆细胞[1，2]。

HOC具有较大的增殖潜能，许多动物模型可激活HOC增殖，如：采用肝毒性药物dipin、fumonisinB1、呋喃妥因(furan)、2－乙酰氟胺、惹卓碱(retrosine)等抑制或消除肝实质细胞的再生能力，再行部分肝切除，可诱导HOC增殖[1，2，3]。Kountouras等[4]对部分肝切除后HOC增殖和肝再生情况进行了研究，认为HOC增殖并不会引起过度再生，因为机体可通过兴奋或抑制细胞周期基因表达，促进细胞凋亡来抑制肝过度再生。

HOC能表达一系列抗原，在分化成肝实质细胞的过程中通常表达白蛋白和甲胎蛋白（AFP）（随着肝细胞的分化成熟，AFP的合成也随之停止），并同时有胆管上皮细胞角质素 (cytokeratins) CK7、CK8、 CK18、CK19和间充质波形蛋白(vimentin)的表达；鼠单克隆抗体OV6可标志大多数HOC，而OC2和OC3（干细胞标志物）则标记其亚群；HOC与造血细胞有许多共同的抗原决定簇，如Thy-1,CD34,SCF,c-kit[1，2，3]。

最近，对多种卵圆细胞系进行了体内研究，发现在一定培养条件下，这些细胞会逐渐失去原有形态，光镜和电镜下表现出典型的肝细胞或胆管形态学特征。Yasui等[5]通过两步胶原酶灌流分离，离心细胞混悬液，再用胶原酶消化，蛋白酶除去残留肝细胞，可分离出卵圆细胞，温育60分钟后，可接种于含10％胎牛血清的William’s E培养基中培养。从Long-Evans Cinnamon大鼠获得的卵圆细胞，植入白蛋白缺乏症的大鼠后可分化成能合成白蛋白的肝细胞，从而纠正了无白蛋白血症。利用三维胶原胶基质培养系统，经过4周的培养，从超微结构和免疫组化方面，证明了肝细胞是由卵圆细胞分化而来。近年来用［3H］-TdR或BrdU来进行体内 脉冲跟踪标记（pulse-chase）增生细胞的DNA，以及用基因标记新技术和卵圆细胞注射等体内标记方法，都证明了卵圆细胞系能够向肝细胞分化，并认为肝损伤的范围和程度可能决定着HOC反应的位置、程度和结局[3]。

2.对人类HSC的研究

由于对人类肝干细胞研究受到限制，有关肝干细胞方面的研究资料大多来自于啮齿动物。迄今，对人类肝干细胞的研究方向一直是通过形态学和免疫组化来鉴定卵圆细胞的子系。研究发现许多标志性表达蛋白，如：胆道标志CK7、CK19和HEA-125；“神经内分泌”标志嗜铬粒蛋白-A，甲状旁腺激素相关肽；肝细胞标志HepPar1、白蛋白和α1抗胰蛋白酶，可用于区分不同类型的卵圆细胞。然后从免疫表型、细胞位置和形态方面推理卵圆细胞分化是沿着胆系还是肝细胞途径[3]。

2.1.亚大块/大块肝坏死

Roskams等[6]利用OV－6、CK7、CK19、嗜铬粒蛋白－A和细胞黏附分子N－CAM抗体对20例亚大块坏死后卵圆细胞的再生进行了监测，发现在再生的早期，肝细胞呈区带性和弥漫性的脱落（drop-out）同时伴有对OV－6、CK7、CK19和嗜铬粒蛋白有免疫反应性的卵圆细胞的增生。在再生后期，“反应性胆小管”表达有上述标志物。这些小管延伸进入汇管区附近的实质，与过渡肝细胞样细胞相接(in continuity with)，过渡肝细胞比成熟肝细胞小，嗜碱性，有OV－6、CK7和嗜铬蛋白-A表达，但无胆道标志CK19的表达，OV－6的表达是卵圆细胞向肝细胞分化的标志。成熟肝细胞不表达任何这些标志。在再生晚期，过渡肝细胞进一步延伸进入肝小叶，细胞的数量随肝损伤肝细胞坏死的严重性而增加。亚大块坏死后出现的小管肝细胞 (ductular hepatocyte)可能是一种“来自Hering管内或附近前体细胞的短暂扩增的细胞簇”。

2.2.慢性胆汁瘀积性肝病

       Roskam等研究了30例胆汁瘀积性肝病，包括原发性胆汁性肝硬化12例，原发性硬化性胆管炎8例和肝外胆道阻塞10例，发现在汇管区纤维隔膜和实质间有不同程度的网状小管反应，“过渡肝细胞”数量较少，并在肝腺泡的zone1区形成簇和玫瑰花结样结构，过渡肝细胞仅在硬化的病例中才伸展进入zone2，与亚大块坏死后再生肝中所见的情况相反。

2.3.局灶结节增生（focal nodular hyperplasia, FNH）

在人局灶结节增生的隔膜（septae）附近发现类似于大鼠卵圆细胞的小的未成熟肝细胞，常规HE染色很难区分二者，这些细胞表达有OV－6、CK7、CK19和嗜铬蛋白－A。在纤维隔膜内的小管也表达这些标志物并呈现N－CAM抗体反应阳性。间隔周围的小过渡肝细胞与胆小管相连，偶尔形成腺泡样结构，这种细胞也表达有OV－6、CK7和嗜铬蛋白－A。这些结果提示在FNH中肝干细胞被活化并支持卵圆细胞起源于中隔胆小管。

2.5.肝母细胞瘤

小上皮细胞，与啮齿类动物卵圆细胞有相同的超微结构和免疫组化特征（对CK7、OV-6或OV-1和白蛋白有免疫反应性）。在肝母细胞瘤中，胚胎区内CK19阳性的细胞数量很少，这与其组织学发生的假说一致，即小细胞产生胚胎细胞，进一步分化成胎儿类型细胞。见于混合型肝母细胞瘤内和畸胎型肝母细胞瘤（其中可见骨骼、分层鳞状上皮和其他组织），提示这种细胞是具有多向分化潜能的干细胞。

3.肝干细胞与肝细胞癌(HCC)及肝癌发生

HOC在人类肝癌发生中的作用仍有争议，主要是在肝硬化病人的异常结节中，肝细胞是否会通过间变和增生而发生HCCs,或如动物模型中显示的那样，在分化受阻后HOC主要趋向恶性变化。有报道发现在乙肝相关肝癌病人肝组织中有卵圆细胞，增生活跃的肝结节和癌旁组织中则更为明显。在慢性丙肝、酒精性肝病和遗传性血色病中，HOC增加的数目与疾病的严重程度相关。因此认为：慢性肝病HOC增生的同时，发生HCC的危险性也随着增加。

来自形态学、血清学、生化、免疫表型和RLE(rat liver epithelial) 移植方面的资料，表明HOC可能与肝癌相关，但迄今没有发现直接证据。Teeber和Becker[3]给大鼠喂食0.06％的2-AAF，以给药2周，停药一周为一周期。用药三个周期，肝脏内有结节形成但可逐渐消退。而用药四个周期，部分肝内结节则持续存在，约24周后部分发生HCCs。同种方法用于不同株大鼠（Fischer而不是Sprague-dawley）也会产生卵圆细胞增殖。致癌物刺激后，在异常结节内及其周围，均可见卵圆细胞来源的小管结构。除HCCs外，在实验大鼠内也发现有胆管纤维瘤及少见的胆管癌。因此认为，刺激卵圆细胞过度增生可促进胆道和肝细胞的恶变。

通过跟踪血清中及肝细胞和肝卵圆细胞内的AFP水平，可了解肝细胞致癌原的早期作用。用AFP还可鉴定潜在的HCC前体细胞。在人类肝脏恶变前，小结节中的“假腺”或腺泡状排列可作为判断异常结节分级的标准。把经过化学药物刺激转化的大鼠卵细胞样肝上皮细胞株，植入一天龄Fischer大鼠的背部或腹膜腔时，会产生125种肿瘤，大部分类似于人的HCC、胆管癌和肝母细胞瘤、还有腺癌、上皮细胞－间叶细胞瘤、表皮瘤、肉瘤及其它差分化的和未分类的肿瘤等，此发现表明卵样的RLE细胞有多潜能性和HOC在肝癌发生中可能起一定的作用[3]。

4.HSC临床应用的研究进展

目前HOC可以被分离纯化和培养。Suzuki等[7]建立了一种鉴定肝干细胞的体外培养系统，把这个培养系统与FACS(fluorescence activated cell sorting)结合，从鼠胎肝中分离出了能够形成大克隆并较长时间产生子代的一簇细胞，使用流式细胞仪使这些细胞浓集。多种生长因子和细胞因子及细胞外基质对HOC的存活和分化有重要影响，Mizuguchi等[8]发现骨髓来源的基质细胞（BMSC）在培养中能促进大鼠肝细胞的增生和分化，把肝细胞与BMSC共同培养会增加小肝细胞的克隆表达。

肝干细胞或起源于它们的肝细胞移植将来可用于治疗急性肝衰竭，以改善其肝功能。移植部位的选择对移植肝细胞的植入和存活至关重要，有报道移植到腹腔，移植细胞在三天内就会坏死。而肝细胞移植入动物脾脏，或通过门静脉灌注及同时植入脾和肝内，可使移植的肝细胞长期存活[3]，这为急慢性肝病的治疗带来了希望。肝细胞移植可作为肝衰竭病人行肝移植前的过渡治疗，在等待移植期间，病人能接受的肝细胞的数量在理论上无限的。肝细胞移植也可用于代谢性疾病如Wilson’s病、高酪氨酸血症、肝脏蛋白缺乏症（如IX因子缺乏）等的治疗。

通过门静脉灌注进行肝细胞移植已用于鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症的治疗，目前正尝试用这种方法矫正纯合子家族性高胆固醇血症，尽管降低血清中胆固醇作用不能长期保持，但仍可明显延长病人的生存期。最近，一例同种异体基因肝细胞移植取得了一定程度的成功[9]，供体5岁，其死后肝脏移植到一个10岁的患有Crigler-Najjar综合症I型的女孩体内，供体肝细胞通过胶原酶灌注分离并予ABO血型相容性配型。经门静脉插管肝细胞移植后，病人的代谢缺陷被部分矫正，血清总胆红素下降，疗效保持11个月，增加了对感染的耐受性并减少光疗的需要。除了一过性的AST和ALT升高外，未有其他并发症。虽然免疫抑制剂只应用6个月，但移植后11个月时，并没有出现排异反应。虽然这只是一篇个案报道，其结果是相当鼓舞人心的。

可供移植的肝细胞供体有限，不适合器官移植的肝脏有可能被作为细胞的供体。肝脏干细胞的分离和培养为解决肝细胞移植的细胞来源提供了一个新的思路。最近有报道：造血干细胞具有卵圆细胞的干细胞功能，并且动物肝细胞将来也可能用于人类肝细胞的移植[10,11]。在人肝细胞癌附近寻找肝干细胞和卵圆细胞时，发现造血干细胞标志CD34阳性。Theise等[11]用用于标志X和Y染色体的荧光原位杂交（FISH）技术，在接受雄性供体骨髓移植的雌性受体的尸体和肝脏活切标本中发现含Y染色体。作者也在反复发作的接受过女性供体肝细胞移植的男性慢性丙肝病人的肝脏中检测到了Y染色体阳性的肝细胞簇和期望的X染色体阳性细胞。Avital等[12]发现在大鼠和人的骨髓中β2微球蛋白（－）/Thy－1（+）的细胞持续表达肝特异性的基因和功能，当被经门脉内灌注入大鼠肝脏后，骨髓来源的肝干细胞与肝板整合并分化成为成熟肝细胞。

  

   肝干细胞的研究是当前的热点，其涉及到：胚胎前体双潜能肝干细胞；成年肝细胞，也被认为是单潜能定向干细胞；卵圆细胞，一种非实质多潜能肝干细胞；造血干细胞，具有多向分化潜能的造血干细胞[13,14]。这将为肝细胞移植和生物人工肝提供一种新的肝细胞来源。通过体外基因修饰卵圆细胞，再移植给有相应基因缺陷的肝脏，使其转变成正常功能的肝细胞，可用于治疗一系列肝脏代谢或病毒性疾病。用胚胎干细胞进行操作，通过细胞移植进行治疗，是一种基于核移植技术的治疗性克隆策略，在科学上、伦理上和法律上都是可行的新思路，并有可能以此进一步获得肝脏等组织工程器官。