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1楼
发表于 2003-10-25 07:00
第一军医大学南方医院影像中心 姜涛 综述 张雪林 审校
摘要 原位肝（orthotopic liver transplantation,OLT）移植由于供体缺乏、免疫排斥反应等原因，在临床上的应用受到很大的限制。肝细胞移植可为肝衰竭病人等待供体期间提供有力的代谢支持，亦可作为治疗先天性酶缺乏及多种代谢性异常的手段。肝细胞移植主要有腹膜腔内、肝内、肾包膜下和脾内等几种方法，而脾被证明是最佳植入点。本文对经脾肝细胞移植的动物实验进展、临床应用及所期待解决的主要问题作一全面综述。
关键词 肝细胞 移植 脾 深低温 基因治疗
肝细胞移植(hepatocytetransplantation,HT)起源于本世纪70年代，途径主要有腹膜腔内、肝内、肾包膜下和脾内等几种方法。早在1975年Mito等就已证实脾是肝细胞移植的最佳场所[1]。来自门脉血的丰富的营养物质和亲肝因子，尤其是脾红髓的网状组织结构,有利于细胞间的相互作用, 这些都为移植的肝细胞的存活和功能的表达提供了有力的支持。无论是成熟或是胚胎肝细胞脾内植入后，均可长期存活，并且表达出白蛋白、胆汁的代谢和酶的功能。
1． 经脾移植肝细胞组织学和增殖
1．1 组织学 肝细胞脾内移植后，不但可以存活, 而且长期观察后见已出现细胞分裂 ,并可见排列成索状的肝细胞 ,占据脾实质40%，形成“肝化脾”(intrasplenic spleen)。其PAS染色阳性，说明肝细胞可以在脾内存活, 且未出现排斥反应。肝细胞在脾脏存活并且PAS染色见有大量糖原颗粒 ,说明在脾内的肝细胞仍具有肝细胞的特点。移植的肝细胞在脾内经历早期变性、坏死，后期生长、增殖过程。应用酶组织化学染色的方法观察到，移植于脾内的肝细胞具有一定的代谢功能 ,并且随移植时间延长 ,酶功能增强。植入的肝细胞除生存于肝、脾和肺以外，还会迁移到心、脑和肾等重要器官存活并保持正常的肝细胞形态 ，同时还表达了合成糖元及增殖功能。
1．2 经脾移植肝细胞的增殖 尽管脾内移植的肝细胞可以生长繁殖并终生具有功能，但肝细胞的功能性质块太小，无法取代全肝的支持作用。依据肝细胞的数量和白蛋白的合成水平，脾内移植肝细胞质块仅能达到全肝的百分之几。肝化脾增量不足及其再生周期太长是阻碍脾内肝细胞移植在临床上进一步推广应用的主要原因。早期有报道发现肝细胞移植后，受体鼠直至死亡，脾内移植的肝细胞也仅占被切除脾表面的大约40%左右。
肝硬化与脾内移植的肝细胞具有相互作用。肝硬化后肝细胞毒性因子被释放入血液，引起肝细胞凋亡和功能的丧失，导致实验动物脾内的肝细胞无法得到保持功能和自我更新所必须的营养物质。移植于脾内的肝细胞可能会分泌某种长效活性物质以刺激肝细胞再生[2]。而细小肝细胞质块脾内移植提高肝衰竭动物的存活率有赖于自身病肝的存在。经动物实验证明，受体肝70%的切除及门腔静脉吻合可以持续刺激移植的肝细胞DNA合成及其增殖，但与受体变性坏死的肝脏相比则明显不如。这种差异可解释为受损的肝脏可分泌一种血清因子促进植入的肝细胞增殖。肝细胞生长因子是肝细胞生长和DNA合成的强大刺激剂 ,被认为是损伤或切除后肝细胞再生的最重要的刺激因子之一。肝细胞生长因子能特异性地促进肝细胞增殖。因此，脾内肝细胞移植后持续静脉内注射肝细胞生长因子以保持其血液内的较高浓度，可以有效刺激植入肝细胞的增殖。其他的门脉性营养因子如胰岛素，胰高血糖素、甲状腺素、表皮生长因子等均可促进植入的肝细胞增殖。与成熟肝细胞相比，胚胎肝细胞对胰岛素、胰高血糖素以及表皮生长因子诱导的增殖反应更敏感。近两年研究表明基因转染所获得的永生化肝细胞可有效解决肝细胞增殖的问题, 但由于具备癌基因的表达，其作用机制也就是肿瘤细胞逃避免疫监视、抗凋亡及摆脱正常的细胞周期，以达无限增殖的机制，因此安全性受到置疑。
与其它可移植部位相比，选择脾可以明显提高自体和异体移植的肝细胞的存活率，另外肝细胞存活期长、增殖快、提高血液生化质量，并可纠正肝细胞生长因子与转移生长因子的不均衡。
2．肝细胞移植的免疫学研究
2．1 自体肝细胞移植 自体肝细胞移植比原位肝移植较易发生凋亡，其原因可能是上皮细胞分离后失去间质支持以及缺血再灌注等因素引起。Olszewski等[3]等观察到自体肝细胞移植长时间后移植肝细胞量存在逐渐减少的现象,认为在用胶原酶分离时可能存在肝细胞膜的损伤,引起肝细胞表型的改变,自体肝细胞移植后被自体免疫淋巴细胞识别为"异已"而受到细胞毒T细胞攻击。
2．2 同种异体肝细胞移植 在不使用免疫抑制剂的情况下,同种异体肝细胞移植时移植肝细胞只能在受体内生存不到7天。肝细胞移植所致的免疫排斥反应中起主要作用的是组织相容性问题。大鼠同种异体肝细胞移植时参于免疫排斥反应的主要为T淋巴细胞及微弱的体液免疫。同种异体肝细胞经脾移植具有高度的免疫原性而非免疫耐受,并能够刺激通过CD4和CD8阳性细胞介导的强烈的免疫反应。宿主T淋巴细胞对移植的肝细胞的作用机制是通过CD28/CD28配体及Fas/Fas配体两条途径实现的[4]。 因此阻断CD28与和它的配体-CD80和CD86的相互作用，可抑制其对细胞毒性T细胞的同种异体反应性诱导或T细胞的增殖，从而延长同种异体移植物的存活时间。而肝细胞对Fas介导的细胞凋亡尤其敏感[5]。用Fas配体阻断蛋白FILM58阻断Fas配体与Fas受体的相互作用，可抑制同种异体脾内移植肝细胞的凋亡，从而延长生存时间。亦有实验证明同种大鼠肝细胞移植时有补体(主要为C3)及少量的抗体(主要为IgM)参与免疫排斥反应。
2．3 异种肝细胞移植 异种肝细胞移植较易发生肝细胞的死亡，原因除免疫排斥反应外，还可能是肝细胞制备过程中的缺氧、离心等因素触发了细胞的凋亡过程 。也可能是异体移植的肝细胞由于缺乏门静脉营养因子而发生退变。异种肝细胞移植同样可逆转暴发型肝衰，提高实验动物的存活率，有报道称与同种移植无显著性差异。使用环孢素A作为免疫抑制剂是较常用的方法,但效果并不完全满意。如何抑制排斥反应是异体肝细胞移植所要解决的主要问题。
3．经脾肝细胞移植的方法和技术 在肝细胞的获取、分离和纯化过程中，应寻求更加有效的技术，避免其损伤，从而最大限度地获得可用的肝细胞。目前较通用的肝细胞的制备方法是Berry-Friend法。脾内移植的肝细胞数量则因动物的不同而异，小鼠为106级，大鼠为107级，大的哺乳动物如狗为109级 ,移植量占宿主肝细胞量的3%左右。很明显，如果植入细胞数过少，发挥的功能有限，若要使移植肝细胞替代受体肝脏的功能，应在 1 5%以上；但若植入过多，除可能引起肝功能损害和重要器官的栓塞外，还会因为肝细胞过分拥挤而影响营养物质的充足供应，导致存活率降低。因此，经脾移植肝细胞时必须暂时阻断脾蒂，以防止植入的肝细胞经血管迁移至肝脏和其他重要器官，前者会引起肝脏的损伤，后者也将引起严重的后果，尤其是肺栓塞和肺内肝细胞分流，另外还可引起门脉压升高，这在肝硬化病人显得格外重要。由于脾脏的容积小，可以通过少量多次输入肝细胞来解决。
对于供体肝细胞的来源，可以是自体、异体或是胚胎肝细胞。经纯化后的胚肝细胞去除了大量的造血干细胞及其他相关细胞，从而避免了供体细胞的多重免疫原性，并且由于供体细胞的绝对数量减少，也降低了门静脉栓塞和肺栓塞的危险，进而增加了移植的总体效率。纯化后脾内移植的胚肝细胞的面积密度和增殖期比率都明显高于成年肝细胞，而且胚肝细胞能较好地耐受分离过程，脾内植入后不引起线粒体酶导致的氧化性损伤[6]。此外，由于胚肝细胞供体来源相对丰富，易于进行体外基因调控，故认为经免疫吸附等纯化获取的胚肝细胞是一种更为理想的肝细胞供体来源。
采用深低温冻存肝细胞植入实验动物体内，可明显提高实验动物的存活率，其机理可能是影响移植抗原决定簇的暴露和改变抗原蛋白功能区的特性，阻碍抗原与抗体之间的结合，从而降低肝细胞的移植排斥反应。如果将肝细胞经深低温冻存后建立长期的肝细胞库以解决供体来源问题，达到随取随用，那么不难想象，这项技术将更有前途。
4．经脾肝细胞移植的应用进展
4．1 动物实验 早期的研究证明肝细胞移植可纠正体内代谢紊乱、延长肝衰竭动物的生存期。Nikolaos 等[7]等研究了鼠经脾同种异体的肝细胞移植，发现只需要相对较少的细胞数即可延缓肝性脑病的发生，显著延长生存期，而且移植后的大鼠血氨水平低，具有较好的凝血机能和较恒定的体温。近期的研究表明移植的肝细胞可为失代偿性肝硬化、不可逆性门脉高压动物提供显著的代谢支持。Malhi[8]报道了经脾肝细胞移植治疗肝豆状核变性，植入的肝细胞可恢复大鼠的铜代谢平衡。
肝细胞移植可以作为肝基因治疗的途径之一, 是近年来的研究热点，即将目的基因经载体携带后，导入离体肝细胞再移植入体内, 从而获得目的基因的表达，进而达到防止和治疗遗传性或获得性肝脏疾病的目的。Gupta等[9]将转导过HBsAg基因的鼠肝细胞移植入同种异体受体脾内,血清HBsAg可在相当高的水平表达, 在一个稳定的范围内持续表达几个月，从而证明肝细胞基因治疗的可行性。Inagaki M[10]等也证实外源基因导入离体的肝细胞在大鼠体外和脾内均得到良好的表达。国内研究表明，化疗后脾内移植粒-单核细胞集落刺激因子基因修饰的小鼠胎肝细胞不仅能促进外周血白细胞数目提前恢复，尚能提高中性粒细胞比例，有助于宿主度过致命的感染期。另外，白介素2(IL-2)修饰基因的鼠肝细胞可有效激活肝脏的免疫反应，也是肝癌基因治疗的有效途径。目前应用于动物实验治疗遗传性肝病的基因导入方法主要有两种，即同种异体肝细胞移植和自体肝细胞移植。同种异体肝细胞移植有两个明显的优势，一是受体不需要接受创伤性外科手术过程，二是可多次植入，从而避免了反复的自体肝细胞的收集过程。同种异体肝细胞移植面临的主要问题是免疫排斥反应问题；而通过自体肝细胞移植，收集受累个体的肝细胞，经逆转录病毒重组体导入功能基因，重新输入体内（经脾或门静脉），不但可纠正自身的功能障碍，其安全性已经动物实验证实（如上所述），这被称作基因导入治疗。肝细胞特异性基因的表达与植入的位置有关, 经脾移植可获得绝大多数基因的可靠表达，而肝细胞的分离过程也影响这些基因的表达。
肝细胞基因治疗的研究越来越深入和广泛，已经有越来越多的基因用于肝细胞的基因治疗。胎肝细胞的优势已如前述，近年来的研究多集中于胎肝细胞的基因导入疗法, 其增殖优势已如前述。
4. 2 临床应用 目前肝细胞移植的临床应用主要是为肝衰竭病人提供代谢支持以及利用基因重组技术纠正体内的代谢紊乱。对于慢性肝衰竭，如肝硬化，由于供体不足及缺乏有效的应急措施, 不能行原位肝移植的患者，用简便的经脾肝细胞移植能够有效地提供短期的肝功能支持, 抑制肝细胞结节增大、胆管细胞增生、肝硬化小结形成, 调节正常肝细胞的生长, 纠正肝性脑病。增加生存的机会。Mito[11]等首先报道了用自体肝细胞脾内肝细胞移植治疗10例肝功能ChildC级的肝硬化或慢性肝炎患者,移植量约10×106～10×108,其中8例患者在肝细胞移植后1～11个月可检测到脾内存活的肝细胞， 1例患者腹水量及血氨水平明显下降,康复良好。国内亦有应用自体肝细胞脾内植入治疗10例晚期肝硬化病人，其中有6例获得较好的临床缓解，延长了生存期。Grossman[12]等利用重组逆转录病毒导入LDL受体基因，成功地为一位29岁妇女治疗了家族性高胆固醇血症。
5．问题与展望 经脾肝细胞遗址所临床应用所面临的主要是如何促使植入的肝细胞增殖并让其长期发挥功能，并摸索出适用于人体的最佳肝细胞移植数量，克服异体移植的免疫排斥反应，保证有效性和安全性，以及做好移植后的监测。随着分子生物学实验技术的发展及人们在分子水平对肝细胞移植的认识，特别是基因治疗和深低温冷冻技术的发展无疑为人类急慢性肝功能衰竭及遗传性肝疾病的治疗开拓更加广阔的前景。
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