乙型肝炎病毒感染的免疫反应

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上海交通大学附属第六人民医院感染病科 臧国庆 余永胜 汤正好

　　HBV在成年人感染后大多被清除，而母亲通过垂直传染途径，常导致儿童HBV持续性感染。目前全球有超过3.5亿的HBV持续感染者，并且有发生肝硬化和肝癌的危险。HBV感染的预后取决于宿主与病毒间的相互作用。急性自限性肝炎，多数HBV在临床症状出现前的潜伏期被清除，免疫细胞所产生的抗病毒细胞因子在此过程中起到诱导作用，继之出现抗原非特异性的肝内细胞大量浸润，其程度与临床症状和肝脏损伤的程度一致。急性自限性肝炎的转归表现为HBV被清除，中和抗体产生，HBV特异性T细胞持续产生，后者监控可能存在的残余HBV-DNA。疫苗可进行有效的预防，但对慢性肝炎治疗的研究有助于减少肝硬化及肝癌的发病率及死亡率。本文对急性自限性肝炎及慢性肝炎的免疫反应；机体免疫状况对病毒复制及肝损伤产生的不同影响；免疫学治疗的有关展望等问题予以总结。

　




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一、急性自限性肝炎的免疫反应

　　肝脏是一富于先天免疫反应细胞的重要器官，其包含NK细胞，自然杀伤T细胞(NKT)，库普弗细胞。这些细胞能快速分泌一系列抗炎细胞因子，它们有抗病毒的效果，活化和维持先天免疫反应，启动抗原特异性的免疫反应等。任何病毒感染，被感染细胞本身是一道防线。多数细胞能快速识别dsRNA的存在，并产生IFNα/β。IFNα/β通过产生2，5寡腺苷合成酶，drRNA依赖蛋白激酶(PKR)和蛋白合成抑制物，能干扰包括HBV等多种病毒的复制。IFNα/β还具有聚集并活化巨噬细胞的作用，后者能分泌多种细胞因子和化学因子，其中CCL3(以往称巨噬细胞炎症蛋白1α，MIP1α)，它能聚集NK细胞，NK细胞在潜伏期的早期阶段及肝损伤出现临床症状之前数量增多，这些早期的反应与NK细胞具有可在MHC-I上调之前识别靶细胞的能力有关，通过识别靶细胞，NK细胞可能直接溶解HBV感染的细胞，通过产生IFN-γ及TNF-α抑制HBV的复制。另外 NK细胞还产生CCL3，CCL4(MIP1β)和CCL5(以往称RANTES)，它们有助于多形核白细胞的分布和迁移。另一类主要的天然免疫细胞包括NKT细胞，NKT细胞能表达NK和T细胞的标志物及T 细胞受体。它能介导直接溶细胞作用，并快速地产生大量的IL-4和IFN-γ，并对特异性免疫细胞的启动产生影响。实验表明利用通过CD1d分子递呈的非肽抗原α半乳糖神经苷酯能活化NKT的一种亚群，将α半乳糖神经苷酯注射到HBV复制的转基因鼠体内，活化的NKT细胞产生IFN-γ并减少HBV的复制，同时IFN-γ诱导及活化NK细胞又增强了这种作用。它并不依赖常规T细胞的作用，因为在T细胞缺乏的小鼠能观察到上述作用。另一种NKT亚群受CD1d限制，但表达不同的T细胞受体，不能识别α半乳糖神经苷酯。当这种细胞在免疫低下的HBV转基因鼠体内，会自发地被激活，并引起肝炎。这些资料表明NKT细胞在机体早期对HBV的免疫中和作用。天然的免疫反应与后天的免疫通过在肝脏的一种特殊的巨噬细胞群库普弗细胞相互发生影响。实际上通过非HBV特异性刺激活化的巨噬细胞，继而产生IFNα/β，IFN-γ及TNF-α；NK细胞、NKT细胞及T细胞的聚集，在HBV转基因鼠模型能有效地下调HBV的复制。细胞因子控制感染的起始阶段，病毒的最终清除及预防再感染需要后天免疫反应的参与。巨噬细胞及树突状细胞吞噬病毒蛋白和凋亡细胞的碎片，并将抗原转送至淋巴结，并启动抗原特异性免疫反应，且产生大量的化学因子，如CXCL10(IP-10)、C 3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL2、CCL7、CCL8、CCL13和CCL5(RANTES)，这些因子招募更多的抗原特异性或非特异性的炎性细胞到肝脏。因此，肝内天然免疫反应通过分泌细胞因子，感染细胞的溶细胞作用，活化肝内免疫细胞，抗原特异性细胞的影响，细胞因子及化学因子介导的炎性细胞的聚集，增强MHC-I表达及HBV特异性T细胞对抗原的识别多种途径，有助于对HBV复制的早期控制。

　　
　　由于特异性免疫反应能特异地识别HBV感染的细胞并维持保护性的HBV特异性的免疫记忆，因此在宿主抗HBV的非溶细胞病毒防御中具有重要作用。特异性抗体模式与HBV感染的不同阶段及预后有关，且被广泛应用于HBV的诊断。抗-HBc是急性HBV感染的第一个抗体标志，抗-HBe是急性自限性肝炎恢复的早期标志，向抗-HBe的血清转换常伴随肝脏病变程度减轻，ALT的正常，在没有前C区变异的情况下，病毒载量往往下降。感染上述变异HBV或同时感染野生型和变异型株时，可检测不出HBeAg，但保持着高水平的病毒载量。针对S、PreS1、PreS2区的抗体有中和作用，在HBV感染恢复期，HBsAg被清除时出现。它们的产生是T细胞依赖的过程，在肝炎恢复期或注射疫苗后，抗HBs滴度在10ml/L以上时有保护性作用。HBV特异性细胞免疫反应是CD4+Th细胞和CD8+细胞毒T细胞介导的，CD4+Th细胞识别抗原递呈细胞上的MHC-II分子与经过吞噬蛋白处理后的抗原肽复合物，因此抗原递呈细胞无需被HBV感染后才能被CD4+Th细胞识别。CD8+T细胞识别MHC-I与细胞内合成的病毒蛋白肽复合物，抗原递呈细胞是HBV感染细胞或被病毒感染后凋亡的细胞。通过T细胞受体T细胞被活化，HBV特异性T细胞完成一系列免疫调节作用。CD4+Th细胞有助于B细胞的分化活化，有利于CD8+T细胞的诱导和维持，有助于树突状细胞对效应T细胞的活化，CD4+T细胞亦分泌可抑制HBV和其它病毒复制和基因表达的IFN-α，IFN-γ，与主要的效应CD8+T细胞一样，CD4+T细胞亦可能直接溶解HBV感染的靶细胞。急性HBV感染病毒被清除与有效的多克隆及多种特异性的CD4+T、CD8+T细胞对HBV各种病毒蛋白所产生的免疫反应有关，HBV感染后一周，ALT升高及HBeAg和HBsAg消失，抗HBsAg产生之前，在患者的外周血中可检测到有关的细胞免疫反应，HBV感染后痊愈的患者大多数表现出显著水平的HBV特异性免疫反应：CD4+T、CD8+T细胞对多种HBV蛋白产生免疫反应；多种HBV抗原肽表位与多种亚型的HLA形成的复合物能被免疫识别；HLA的位点的多样性增加了能被免疫识别的抗原表位数量，此与HBV感染较好的控制有关，单个HBV的抗原表位能被多个T细胞克隆以不同的T细胞受体方式进行识别，显示HBV特异性免疫反应的多克隆性。相比较在慢性乙型肝炎患者外周血不易检测到这些免疫反应，因此这些研究表明显著的多种特异性T细胞免疫反应与HBV的清除有关。对HBV感染的两只黑猩猩进行前瞻性研究分析发现，在感染的潜伏期HBV的复制已达到最高水平，此时未见ALT的升高，与HBV是非细胞毒病毒的特点一致。在临床症状出现之前的潜伏? 肝内免疫反应已启动，临床症状出现之前的数周HBV-DNA的翻译模板cccDNA在IFN-γ产生的同时已开始下降，CD4+T、CD8+T细胞免疫反应在此阶段已被检出。表明通过天然或特异性免疫反应在HBV感染的早期临床症状出现之前，肝内及血清HBV-DNA能被清除。利用转基因鼠对细胞因子介导的HBV复制及病毒基因表达抑制机制研究，能表达HBV所有蛋白，复制HBV并产生有感染力病毒颗粒的转基因的产生有利于病毒清除及免疫病理机制的全面了解，通过选择性地传输HBV特异性的CD8+T细胞能在这些鼠体内诱发急性肝炎，在注入一小时后肝内出现浸润的CD8+T，能识别表达HBV有关抗原并与MHC-I结合的肝细胞。这种在选择输入抗原特异性的CD8+T与肝细胞的相互作用可有两种效应：CD8+T能诱导单个肝细胞的程序性死亡，噬酸性小体的形成，由于这种细胞损害需细胞间的直接接触，因此仅限制少量的肝细胞，同时通过感染HBV的肝细胞的破坏不足以清除细胞浆HBV核壳及HBV复制的中间体。另外CD8+T可通过IFN-γ及TNF-α介导的效应，对HBV感染的肝细胞产生作用，包括对病毒颗粒的形成、HBV的复制中间体及cccDNA模板的抑制，甚至少量的细胞因子可抑制局部的病毒复制。在穿孔素及Fas配体缺乏的CTL可以介导同样的效果，提示HBV的溶细胞及非溶细胞清除可是独立的效果。


　　细胞因子介导的HBV的抑制可发生在急性肝炎的潜伏期以及在还没有肝脏损害的组织学和血清学指标依据时，是何种因素导致急性肝炎的临床症状的出现？对转基因鼠的研究中，急性肝炎有关的多数炎症实际上与HBV特异性T细胞浸润后引起的非抗原依耐性的免疫反应有关，这种免疫反应的扩增由抗原非特异性的T细胞及中性粒细胞榈迹?庑┫赴?芟赴?蜃蛹扒骰?蜃佑跋欤?谧⑸銱BsAg特异性CD8+T细胞后4到12 小时，在转基因鼠体内抗原非特异性炎性细胞聚集到肝脏，包括巨噬细胞、NK细胞、T细胞及中性粒细胞，形成炎性病灶，与肝病炎症损害的临床表现有关。介导前述的抗病毒效应的IFN-γ同样活化巨噬细胞，可增加肝脏细胞对TNF-α介导肝损害的敏感性，诱导肝细胞、肝窦内皮细胞及巨噬细胞产生能吸引炎性T细胞和中性粒细胞、NK 细胞、NKT细胞的趋化因子。肝脏内的γ-IFN的原位表达可持续甚至在缺乏病毒的情况下吸引淋巴单核细胞，引起慢性活动性肝炎，如NKT、NK、Th1/Tc1T细胞产生的γ-IFN诱导趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11的合成， 这些由肝窦内皮细胞、巨噬细胞和肝细胞产生CXC家族中趋化因子较外周血T细胞相比易结合到肝内浸润淋巴细胞受体CXCR3。另外CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)和CCL5(RANTES)在肝脏炎症时上调，CCL3、CCL4主要由汇管区的血管内皮细胞表达，而CXCL9、CXCL10主要由肝窦内皮细胞表达，上述三种趋化因子通过受体CCR5与活化的淋巴细胞结合，因此可不受抗原特异性的限制促使外周血淋巴细胞聚集到肝脏。有依据表明，这些炎性细胞的重新分布与急性肝炎肝损害有关，首先在给转基因鼠输注HBV特异性的CD8+T后，CXCL9、CXCL10的抗体能减少淋巴单核细胞的肝内聚集，减少炎症坏死的病灶范围，降低血清ALT的升高水平。


　　在急性肝炎恢复期，外周血及肝脏HBV特异性CD4+T、CD8+T迅速减少，免疫无能的诱导在免疫下调的过程中起一定的作用，从这些患者的分离的HBcAg特异性的T细胞克隆在抗原刺激下不能产生IL-2，抑制早期抗原特异性增殖反应。尽管HBV特异T细胞大量减少，在HBV抗原存在时机体仍保持很高水平的T细胞反应。体外实验表明用HBV肽再刺激时，T细胞能快速增殖并产生细胞因子，在乙肝恢复后是T细胞反应而不是T细胞的数量决定了免疫状态，这种反应能保持临床和血清恢复后多年不变。

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二、慢性乙型肝炎的免疫反应

　　至今的研究表明所有慢性感染者，甚至在成年感染且具有免疫能力的患者，表现出较弱的HBV特异性的T细胞免疫反应。目前还不知道这些患者是否在急性感染阶段发生强的免疫反应，是否起始的T细胞反应仅限制于很少的抗原位点，或识别非主要位点，是否这种T细胞免疫反应在早期因为分泌的高浓度HBeAg而减弱或者被消耗殆尽。慢性HBV持续感染的几种主要的机制：1.在急性肝炎有利于HBV清除的同样机制可能不能使慢性感染者恢复。功能不全的T细胞反应可能使HBV的复制减弱及抗原表达减少，但不能完全清除病毒，而同时可能通过减少抗原的提呈，逃避免疫识别。2.HBV在短期内感染大多数肝细胞，HBV特异性的T细胞不足以清除所有肝细胞感染的病毒。3.通过在T细胞识别位点的变异，降低T细胞的作用，如抑制T细胞增殖反应，抑制细胞因子的分泌，或抑制针对原位点的免疫反应。在垂直传播的过程中，HBV持续感染可能存在不同的机制。多数HBsAg和HBeAg阳性母亲的新生儿发生慢性肝炎，提示HBV感染的高慢性率与感染时免疫耐受有关。由于用HBeAg有关的肽免疫在新生被感染的小鼠体内能诱导出HBV特异性具有功能的CD4+T细胞，且早期疫苗免疫的儿童能预防病毒的持续感染，提示T细胞的缺陷或无能解释垂直传播后免疫? 受的发生。研究表明HBeAg转基因鼠的刚出生的小鼠表现出较弱的针对HBcAg和HBeAg抗原的细胞免疫反应，提示HBeAg可通过胎盘到达未出生小鼠的胸腺，起免疫耐受原的作用。另有研究报道在HBeAg阳性的非转基因鼠的后代未能发现免疫耐受的证据，推断鼠胎盘对HBeAg有有效的屏障作用。鸭肝病毒(WHV)感染宿主的预后与感染的时间年龄有关。病毒学及免疫学研究表明新生儿感染时肝内病毒载量增加，急性肝炎的严重程度下降，肝内炎症反应减弱，发生慢性肝炎者表现出细胞免疫的强度弱， IFN-γ及TNF-α的表达水平亦相对减弱，因此，新生儿感染的急性期，早期阶段缺乏有效的免疫反应是发生慢性肝炎的重要原因。

　　虽然慢性肝炎外周血HBV特异性的T细胞免疫反应很弱或不能被检测出，但从肝脏活检组织内分离和扩增到HBV特异性T细胞克隆，肝内持续的T细胞及非特异性炎细胞的浸润与进行性的炎症坏死肝损害有关，肝内炎性白细胞浸润的程度是慢性肝脏炎症严重程度的标志，除CD4+T、CD8+T外，B细胞在肝内聚集，并在汇管区、肝窦形成淋巴滤泡，推测这些HBV特异性的细胞免疫反应较弱不能清除所有感染肝细胞的病毒，但损害部分HBV感染的肝细胞。一小部分慢性HBV感染者可自发的降低HBV-DNA的水平，HBeAg被清除，继之HBsAg被清除，抗-HBsAg产生，病情恢复。在自发HBeAg被清除之前，在患者的外周血中能检测到特异性的T细胞免疫反应，这些结果表明在HBeAg清除的过程中，一些患者潜在的免疫介导的清除机制可自发的被激活。实际上在病毒载量及肝鸷τ兴?刂频腍BeAg阴性的患者外周血及肝内显示HBV特异性的T细胞，在肝内超过9%的CD8+T细胞能识别HBV核壳抗原表位并表达活化标志DR。在血中这些细胞显示为静止状态，但具有快速回忆反应的能力包括IFN的产生、细胞毒性及增殖反应的能力。因此HBeAg阴性的慢性乙性肝炎并不完全缺乏HBV特异性T细胞，而显示出HBV特异性T细胞与一定数量而不引起肝损害的病毒复制之间的平，在没有抗-HBs存在的情况下，CD8+T细胞有调节HBV复制的作用，而且在没有肝免疫病理损害的情况下发挥此作用。由于不能完全抑制HBV的复制和清除病毒，引起慢性患者持续的抗原特异性的免疫反应，炎性因子的持续表达和被激活的淋巴单核细胞在肝脏聚集最终导致肝纤维化、肝硬化和肝癌。

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三、抗乙肝病毒的免疫治疗

　　在急性乙型肝炎高病毒载量期间，可观察到HBV特异性的CD8+T细胞存在功能的不完全。体外用相应的抗原刺激后， HBV特异性T细胞可被活化，但表现出不全的增殖及效应功能。有高病毒载量和血清ALT升高的慢性乙型肝炎患者，与较低病毒载量及ALT正常者相比，循环的HBV特异性T细胞体外免疫反应较弱，当急性肝炎急性期后病毒量及HBeAg下降后，HBV特异性T细胞的增殖和效应能力恢复，在慢性肝炎自发清除病毒并出现HBeAg抗体血清转换时，其外周血HBV特异性T细胞反应增加，这些结果提出了当病毒量下降时功能不全T细胞免疫反应可逆转的可能性。最近有研究支持这种假说，用拉米夫定治疗HBV感染者降低病毒载量，可诱导有效的HBV特异性的CD4+T细胞，治疗一个月内在患者的血中可检测到HBV特异性的CD4+T、CD8+T细胞，这种T细胞活性的增强与抗HBs的产生无关，与血中病毒抗原的减少没有相关性。提示通过抗病毒完全抑制HBV的复制在一些患者可能恢复HBV特异性的免疫反应，但不能产生与完全恢复者的免疫状况。

　　在接受有HBV免疫力供者骨髓的数个HBV感染者，观察到HBsAg被清除，这种免疫清除与血中HBc特异性T细胞反应呈相关性。HBc特异性T细胞是供者来源的，是活化的免疫记忆细胞。表明在慢性乙肝选择性的诱导或扩增HBV特异性T细胞可能有助于病毒的清除。

　　选择在慢性乙肝体内诱导HBV特异性T细胞的最佳策略有重要意义。利用HLA-A2限制性HBV CD8+T细胞表位，破伤风毒素CD4+T细胞表位的脂质多肽疫苗诱导HBV特异性的CD4+T细胞反应，正处I期临床验证。但这种免疫反应不足以介导病毒的清除。用重组preS2/S蛋白免疫，可诱导部分患者CD4+细胞增殖反应及IFN-γ的产生，但不能增加HBe/抗HBe的血清转换率，亦不能诱导HBsAg的清除。

　　DNA免疫对多种病原体能产生体液和细胞免疫反应。DNA疫苗免疫HBV转基因鼠可诱导HBV特异性 CD8+T细胞，导致HBsAg从血中清除，肝内HBV-RNA的下降，但在肝内病毒高水平复制时，DNA疫苗不能打破CD8+T细胞的免疫耐受。

　　HBV复制的抑制可不伴肝细胞的损害，利用细胞因子非溶细胞抗病毒效应进行免疫调节治疗。如通过治疗活化肝内NKT或巨噬细胞，在局部或通过旁分泌诱导细胞因子，NKT或巨噬细胞在健康或非感染的肝脏内存在，且在感染时活化不受MHC-I的限制
还有的途径可能通过药物直接作用于细胞内的因素，选择地降解HBV基因组，这种策略避免了由于细胞因子继发的淋巴单核细胞浸润引起的肝损害。

　　肝内细胞浸润所引起的非抗原特异性的扩增，增加了急慢性肝炎肝损害，选择性地抑制这种反应有益于减少肝损害。如：CXCL9和CXCL10抗体能抑制HBV转基因鼠肝内细胞浸润后抗原非特异性的扩增。

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关于ALT升高与体内免疫功能激活 免疫是一个复杂的主题，肝损时说免疫激活是一种病毒性炎症性免疫激活，是机体对病原的最后一种无赖的免疫活化选择，即只有在针对病原如HBV的特异性免疫（获得性、ACQUIRED IMMUNE）和一般的抗病毒免疫功能（先天性、天然、INNATE IMMUNE）均低下时才“江湖义气”、“好管闲事”、“玉石俱焚”、“两败俱伤”地由非抗原特异性免疫活性细胞如Bystander T淋巴细胞和单核细胞等等代偿性参与“作战”，结果“二败俱伤”而误伤组织细胞，故致炎症与坏死。 国外采用先进方法（用MHC-BETA MICROGLONULIN的TETREAMER（四 聚体）技术进行HBV抗原特异性CTL检测）研究发现，只有HBV抗原特异性CTL缺乏时（肝内和血PBMC中均如此）肝内才有大量的Bystander T淋巴细胞和单核细胞等炎性细胞浸润。而且发现，同时小三阳，有肝炎的（ALT上升者）多HBV抗原特异性CTL，而没有肝炎的则多有一定程度的HBV抗原特异性CTL存在。 因此肝炎与免疫功能的关系很复杂，一言难尽，但有一名要记牢，即HBV抗原特异性免疫功能与肝损伤不正相关，反而负相关。事实上，很多正常人便因建立了HBV抗原特异性免疫功能才不知不觉中感染了HBV后不发病而自愈，便是此理。

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乙肝病毒感染并不直接造成肝脏的损伤，但是，由于乙肝病毒感染及其在体内的复制而激发的机体针对性免疫应答反应造成了肝脏的损伤。不过，这个免疫应答过程也是机体抑制与清除乙肝病毒所必须的过程。 肝脏是一个具有巨大再生与代偿能力的脏器，在它受到损伤后如果能及时去除病原则常可得到完全恢复。 如果上述的免疫应答力度足够强大，则病人的临床表现可能为急性炎症。此时病人的转氨酶常可达一千乃至数千单位，如果总胆红素不太高的话，病人的预后常较好，经合理治疗后较快恢复，HBV-DNA转阴而且较为稳定，肝功能恢复正常达到临床康复。这其中还会有相当一部分病人在康复后不久或稍长一段时间出现表面抗原转阴、表面抗体转阳而“一劳永逸”，永不复发。 如果上述免疫应答力度不够强大，则临床表现轻微，甚至无症状，肝脏损伤也较轻，转氨酶常徘徊在一二百个单位以下。这样的免疫应答力度不能有效抑制与清除乙肝病毒，造成病毒在体内繁殖复制一年又一年，肝内的炎症存在一年又一年。长期的肝内慢性炎症刺激肝脏纤维组织增生，其结果是逐步形成肝纤维化、硬化、甚至癌变。 因为上述道理，对临床上转氨酶徘徊在一百以下，HBV-DNA测定在10的6次方以上的乙肝病人称之为“难治性乙肝”。因为这种类型的乙肝病人要使其HBV-DNA转阴、稳定，常需要很长时间，即使使用贺普丁、阿德福伟等抗病毒药物，也常出现起效慢转阴比例低，易耐药，易反跳。 毛主席曾经説过“;事物发展的矛盾诸方面，内因是决定因素，外因是重要条件，外因通过内因起作用。”乙肝的病情进展、治疗与转归的过程正是体现了这一规律。这里，乙肝病人机体的针对性免疫功能是内因，病原、药物与治疗措施是外因。