李文辉发现POLK是乙肝病毒cccDNA形成所需的一个关键分子

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发布时间：2016/11/04
        2016年10月26日，我所李文辉实验室在《PLOS Pathogens》杂志发表题为“DNA Polymerase κ Is a Key Cellular Factor for the Formation of Covalently Closed Circular DNA of Hepatitis B Virus” 的文章。该文章报道了DNA polymerase κ是乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV）共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA)形成的一个关键分子，参与了乙肝病毒基因组松弛环状DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)向cccDNA的转变进程。
        慢性HBV感染是引起肝硬化和肝癌的主要原因。目前已有的抗病毒治疗不能彻底治愈乙肝，一个重要原因在于无法清除肝细胞核内稳定存在的乙肝病毒cccDNA。乙肝病毒cccDNA在感染的肝细胞核内以微型染色体的形式存在。在乙肝病毒的生活史中，HBV rcDNA向cccDNA的转变是乙肝病毒建立持续性感染的必需步骤。然而，以前由于缺乏有效的乙肝病毒细胞感染模型，对于HBV cccDNA形成的生物学特征以及分子机制的认识有限，现有知识主要是基于对鸭乙型肝炎病毒(DHBV) cccDNA的研究。
        李文辉实验室早先发现了乙肝病毒受体钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)，并由此建立了高效的HBV感染HepG2-NTCP细胞模型。在此感染系统上，作者发现HBV感染24小时即可检测到HBV cccDNA的形成，几天后其拷贝数升高随后保持相对稳定，每个感染细胞内cccDNA拷贝数平均为3个。与DHBV cccDNA不同，HBV细胞内扩增途径补充cccDNA的效率不高，cccDNA池主要由初始感染的病毒将病毒基因组rcDNA转变为cccDNA而建立。进一步运用遗传学手段和小分子抑制剂进行实验，结果表明HBV cccDNA的初始形成不依赖于病毒聚合酶。随后通过靶向RNAi筛选实验，发现宿主细胞内DNA polymerase κ(POLK), DNA polymerase λ(POLL)和DNA polymerase η(POLH)参与了HBV感染，其中敲减POLK显示了最显著地抑制HBV cccDNA形成的效果，病毒核衣壳蛋白(HBc)和3.5kb vRNA的表达水平也显著降低。借助CRISPR/Cas9技术敲除HepG2-NTCP细胞中POLK的表达，进一步确认了HBV cccDNA形成过程需要POLK的参与。而敲除POLK没有影响丁型肝炎病毒(HDV)的感染和胆酸盐的转运。在POLK敲除的HepG2-NTCP细胞中过表达POLK即可恢复HBV cccDNA的合成和病毒蛋白的表达。该研究有力地表明在HBV感染HepG2-NTCP细胞模型中POLK是HBV cccDNA形成的关键细胞分子；同时提示在抗HBV治疗中，降低cccDNA需要有效阻断从头感染。该研究还为进一步揭示HBV cccDNA形成的分子机制奠定了良好的基础，HBV感染HepG2-NTCP细胞模型也将推进HBV cccDNA生物学的研究步伐，为开发针对乙肝病毒慢性感染的新疗法提供新的线索。

        北京生命科学研究所和北京师范大学联合培养博士生祁永和为本文的第一作者，其他作者包括郜振超，徐广伟博士，彭博，刘晨萱，严欢博士，姚奇艳，孙国梁，刘阳，汤定斌，宋子林，何文辉博士，孙银燕博士和郭巨涛博士。李文辉博士为通讯作者。该研究由科技部973项目，国家自然科学基金和北京市科委资助，在北京生命科学研究所完成。

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