RNAi药物的前身和今世

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RNAi药物的前身和今世
原创： 前沿递送 罗兹曼国际转化医学研究院  2018-10-12
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2018年8月10日，FDA批准了首款RNA干扰（RNAi）新药Onpattro (patisiran)。该药是一种靶向转甲状腺素蛋白（Trabsthyretin, TTR）的siRNA药物，由Alnylam Pharmaceuticals公司研发，用于治疗由遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性（hATTR）引起的多发性神经病患者。




ONPATTRO™ (patisiran) 包装及试剂瓶 (图片来源 Business Wire)



RNAi从2006年收获诺贝尔奖的荣光，到被认为是医药行业的一大泡沫，再到首款新药获批，走过了一条曲折而艰辛的道路。RNAi技术现在仍是实验室常用的基因沉默处理手段之一，但从实验室中细胞的转染到临床前和临床试验需要跨越巨大的鸿沟。临床试验中，由于无法递送到正确的人体细胞中，RNAi疗法要么无效，要么反而带来危险的毒副作用。制约这条道路发展的关键就是RNAi的载体系统。2010年，Alnylam公司发表利用基于配体的技术对RNAi疗法进行靶向递送的论文，影响整个RNAi疗法领域。这项发现移除了横亘在RNAi新药研发的最大障碍。那么，RNAi和RNAi的递送系统究竟有什么特征？现有的RNAi新药进展如何呢？




1. siRNA结构和性质




双链寡核苷酸siRNA是RNAi的前药。双链siRNA是聚合阴离子，未经修饰的siRNA分子量约13 kD。siRNA有正义链和反义链，反义链为药理活性部分，正义链被认为是药物递送装置，将反义链运送给胞内RNA核酸内切酶Ago2。但正义链因阻碍siRNA的分布和细胞吸收，并非是理想的药物递送载体。同时，因为降解反义链的酶、外核酸酶和内核酸酶同样参与其代谢，siRNA正义链可能还有一定的药理作用。



设计siRNA序列时，首先选择好靶基因。靶点区域为起始密码子AUG开始的50-100个核苷酸（nt），且不包括单核苷酸多态性区域。siRNA序列推荐长度为19 nt，鸟嘌呤-胞嘧啶含量应在36%-52%之间，反义链在5′端必须富含A/U核苷酸，正义链在5′端含G/C核苷酸较多，避免序列间互补和3个以上的同一重复核苷酸，以免引起siRNA二级结构的改变。




2. siRNA的递送载体




由于疏水基被双链结构中的水分子屏蔽，siRNA亲水且不与血清蛋白结合，体内排出快速。为保证有效的组织递送，siRNA必须与脂质或其他类型纳米粒子一起配置，或用GalNAc靶向配体修饰后结合到高容量细胞表面受体上。目前临床研发的siRNA有两种化学类型：天然型和化学修饰型。前者为没有或几乎没有化学修饰的磷酸二酯-寡核苷酸，后者在siRNA其中一条链的3'-末端结合N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）部分或做更广泛的化学修饰。阳离子或中性脂质体（liposome）通常为载体天然型无修饰的siRNA递送装置。



2.1 GalNAc siRNA  



通常用硫代磷酸盐和20-氟代或20-甲氧基等几种2'基团做广泛的化学修饰。当GalNAc部分附着到siRNA时，细胞摄取和分布受肝细胞表达的唾液酸糖蛋白受体介导，摄取主要是通过网格蛋白依赖的内吞作用。药物可在1.25-10 mg/kg范围内皮下注射，通过脱氧糖蛋白受体被肝细胞吸收，吸收迅速。组织清除经核酸外切酶和内切酶代谢，从肝细胞中消除，半衰期数周，由于作用时间长，给药每周一次乃至更长时间。




siRNA递送到靶细胞和适体-siRNA嵌合体和适体结合siRNA加载纳米载体的RNAi胞内干扰机制（图源：WIREs Nanomed Nanobiotechnol）。



2.2 阳离子脂质体



一般由阳性两亲性脂质和二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）和胆固醇等辅助脂质及单磷脂酰酯、霉菌酸酯和鲨烯等免疫调节物组成。商品化脂质体Lipofectamine 2000为DOSPA/DOPE 3/1。单价阳离子脂质代表是DOTMA和DOTAP，其它还有DO-Chol和DDAB；pH敏感的阳离子脂质有DLinDMA、DLin-KC2-DMA和YSK05。



2.3 中性脂质体  



由中性脂质构成，DOPC为中性脂质体。中性脂质体不激活补体和巨噬细胞吞噬，对肿瘤穿透性好。中性脂质体的细胞摄取效率低于阳离子脂质体，可能经非特异性巨胞吞作用进入细胞，因大泡体漏出使得更易胞内逃逸。此外，中性脂质体不能被动加载siRNA，需特殊合成方法和结构将大量siRNA加载到中性脂质体中。因此，中性脂质体siRNA递送系统取决于siRNA的包封率和细胞摄取，体内siRNA递送效果好。



2.4 携带siRNA的脂质体



脂质体siRNA载体分为四种主要类型：脂质体复合体（Lipoplexes）、稳定的核酸脂质颗粒（Stable nucleic-acid-lipid particles, SNALPs）、脂质体多聚复合体（Lipopolyplexes）和膜/核纳米颗粒（Membrane/core nanoparticles, MCNPs）。



脂质体复合体的多层脂质层仅由阳离子脂质体形成，siRNA包埋在相邻的脂层之间。商品化制剂有Lipofectin、Lipofectamine和LipoRNAiMAX等。



SNALP表面为中性，仅有酸性pH敏感如pH=4和pH=7.4的的脂质体才能形成。因静电引力siRNA吸附于内层脂质体表面。



脂质体多聚复合体为阳离子多聚体/siRNA复合体，通过阳离子脂双层包裹阴离子多聚复合体上或通过静电吸引将阳离子脂双层包封在阳离子多聚复合体上，后者较少使用。以PEG化增加稳定性；也可通过脂质膜与多聚复合体直接水合合成。



MCNP具核-壳样结构，一种或多种无机纳米粒子为核，脂质双层为壳。核可以是多孔磷酸钙（CaP）或SiO2纳米颗粒，在其多孔表面负载大量siRNA。脂质双层可以是对称的（中性双层或阳离子双层）或不对称的（阴离子内层和阳离子外层）。由于结构由内部固体纳米颗粒支撑，MCNP比中空脂质体更稳定。MCNP大小取决于核纳米颗粒，MCNP可以非常小（～30 nm）。较小的基因载体利于穿透组织和细胞摄取，基因沉默效率更高。但因需共合成无机纳米粒子，MCNP合成相当复杂。




递送siRNA的4种脂质体结果（图源：Biomaterials）



siRNA与脂质体递送载体的混合物具有强烈的促炎作用。例如，阳离子脂质体的毒副作用就有细胞萎缩、有丝分裂减少、细胞质液泡化及蛋白酶C受抑制，且能激活补体和增加巨噬细胞的吞噬。因此大多数情况下，siRNA必须采用抗组胺、非甾体抗炎药和较高剂量的糖皮质激素等预处理方案。




3. 部分siRNA药物的临床研发进展




3.1 Patisiran



该药是用脂质纳米颗粒（LNP）的脂质体制剂将经少量化学修饰过的siRNA递送到肝脏，并已完成对遗传性TTR淀粉样变性的外周神经病变形式患者III期临床研究，为首个获批的siRNA药物。Patisiran有11个2'-甲氧基修饰的糖残基和4个2'-脱氧胸苷残基，给药前必须用抗组胺药、非甾体抗组胺药和糖皮质激素预处理。



在I和II期临床试验中，用LNP给药的patisiran以剂量依赖的方式降低目标蛋白TTR。在II期试验中，patisiran以0.3mg/kg剂量每三周静注一次，可使TTR蛋白水平降低80%以上。与自然进程相比，药物药理作用直接与疾病进展率显著降低有关。最新报道了对外周神经病变型TTR淀粉样变性患者的随机、安慰剂对照的III期试验数据。225例患者用0.3 mg/kg patisiran或安慰剂每3周一次治疗18个月。在衡量疾病进展和生活质量的标准化评分系统中表现出显著统计意义的受益。最常见的不良反应有外周水肿和输液相关反应。



3.2 QPI-1002



QPI-1002为20-甲氧基和20-羟基间隔修饰的siRNA，抑制p53的表达。该siRNA在临床III期中治疗肾移植的移植物功能延迟，以及II期试验的心脏手术后急性肾损伤（AKI）。I期早期研究发现，接受非紧急泵式心脏术的患者，在泵式心脏术后4小时对生理盐水单次静注QPI-1002耐受良好，剂量测试最高可达10 mg/kg，无明显剂量相关或限制性毒性。该结果得到进一步试验支持，341例心脏手术患者的随机、安慰剂对照的II期试验中，单次静注QPI-1002的患者AKI的发生率显著降低。





3.3 Revusiran



Revusiran是GalNAc结合修饰的siRNA，以增强稳定性并将药物递送至肝细胞，含有2个PS取代基和22个2'-甲氧基和22个2'-氟修饰糖残基。Revusiran是第一个进入临床研究的GalAc-siRNA，皮下给药，靶向转甲状腺素，用于治疗TTR淀粉样变性患者。在志愿者的初期临床试验中，revusiran剂量依赖性地降低血浆TTR蛋白。在26例TTR淀粉样心肌病患者的开放标记II期研究中，先第一周每天5 mg负荷剂量后，以5或7.5 mg每周给药，血浆TTR水平降低超过85％。与自然史相比，数据显示心脏功能障碍进展缓慢。26例患者中有4例发生注射部位反应和肝功升高，据报道为最常见的不良反应。



受II期结果鼓舞，对206例家族性淀粉样心肌病患者进行了随机、安慰剂对照的III期试验。但因不良事件，revusiran试验被终止。研究结果尚未发表，但报告在死亡、肝功能障碍、进行性周围神经病变和代谢性酸中毒方面有问题。这些不良事件的潜在机制信息尚未发表，但是可能是因每周500 mg的高剂量导致的。





3.4 Fitusiran



Fitusiran是最新研发的GalNAc-siRNA，与revusiran不同，有6个PS取代基和23个2'-甲氧基和21个2'-氟修饰糖残基，并已被证明比revusiran更有效。在血友病患者II期研究中，发现其剂量依赖性地降低靶点抗凝血酶的血浆水平。在开放标记延伸臂研究中，剂量为50或80 mg/月，在80mg/月剂量下观察到血浆抗凝血酶大约降低80％。血浆水平的抑制，潜在好处有凝血酶生成水平接近正常下限。25%的患者发生注射部位反应，19%的患者肝功能升高。






3.5 Inclisiran



也许目前报道的最有效GalNAc-siRNA是inclisiran，靶向前蛋白转换酶枯草杆菌素/kexin类型9(PCSK9)。在低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）升高的心血管疾病高危患者的随机、安慰剂对照的II期试验中，第1天和第90天300 mg 皮下剂量inclisiran，第二剂后3个月使PCSK9和LDL-C分别比基线降低69%和53%。该药物也显示出良好的安全性，现正处于III期试验中。




探讨




目前siRNA临床试验还不多，国内也尚无机构或制药公司开展相关临床试验，因此能直接比较siRNA的结果也不多，但GalNAc-siRNA和脂质配制的siRNA之间的差异更令人印象深刻。消除糖皮质激素等预处理能使siRNA向临床迈出一大步；与大量患者的因静注产生的输注反应相比，皮下注射使治疗更加方便，并拓宽了siRNA治疗的效用。但最近终止的几个GalNac-siRNA的临床研发表明，必须更深入了解化学修饰，特别是2'-氟核苷的影响以及设计安全。


正在开展的siRNA临床试验状况（来源：Cell Metabolism和https://clinicaltrials.gov/）