张继明：HBV cccDNA研究现状与挑战

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张继明：HBV cccDNA研究现状与挑战
原创： 临床肝胆病杂志  临床肝胆病杂志  今天
张继明
复旦大学附属华山医院



尽管乙型肝炎疫苗的推广应用已有近30年，全球仍有超过2.5亿慢性HBV感染者，其中，我国的慢性HBV感染者约占1/3以上。如果未接受及时、规范的抗病毒治疗，慢性HBV感染者容易发生肝硬化、肝衰竭及肝癌，并且，即使接受抗病毒治疗也难以完全阻止肝癌的发生。因此，慢性HBV感染目前仍然是世界性的公共健康问题。现有的抗病毒治疗方案可以显著减少血清和肝组织HBV载量，但不能清除HBV感染而达到“完全”治愈，停药后容易复发，导致许多患者需要长期、甚至终身接受核苷（酸）类似物（NAs）抗病毒治疗，其根本的原因是肝细胞核内存在具有转录活性的共价闭合环状DNA（cccDNA）。为了使广大医务工作者了解HBV cccDNA方面的研究进展，本期邀请了国内权威专家，就HBV cccDNA 6个方面的相关进展分别加以介绍。









1  目前抗HBV治疗方案对HBV cccDNA的影响



目前临床上应用的抗HBV药物包括NAs和α干扰素（IFNα）两大类。NAs已成为治疗慢性乙型肝炎（CHB)的主要药物，90%~95%以上符合抗病毒治疗的CHB患者正在接受NAs抗病毒治疗。NAs可显著抑制HBV的复制、降低病毒载量，但需要长期服药，从而可能产生耐药、安全性及患者依从性下降等问题。从作用机制上，NAs不能直接作用于cccDNA的形成。临床研究也证实，NAs短期治疗对cccDNA含量的影响有限，但在理论上，NAs长期治疗可通过持续抑制松弛环状DNA（rcDNA）的形成而影响cccDNA的回补，进而使cccDNA池逐渐耗竭。此外，NAs长期治疗可通过抑制HBV的复制，有可能部分恢复患者的抗HBV免疫应答，从而清除感染肝细胞，降低cccDNA水平。



然而，长期治疗虽然可使肝内cccDNA总体水平逐渐降低，但不能完全清除cccDNA，最主要的原因可能是NAs不能彻底地抑制HBV复制。复旦大学袁正宏课题组利用接受阿德福韦长期治疗的CHB患者肝穿组织，进行原位cccDNA检测，发现患者的血清HBV DNA虽然低于检测下限，肝内HBV抗原水平和细胞浆HBV DNA水平大幅降低，但肝细胞核内仍可检测到一定水平的cccDNA。其他研究也报道，即使接受长达10年以上的NAs抗病毒治疗，且血清中HBV DNA水平持续低于检测下限，但肝组织中仍可检测到cccDNA。以上提示，尽管长期NAs治疗可使血清中的HBV得到抑制，但肝组织内仍存在低水平的HBV复制，没有完全切断cccDNA池的补充。在长期NAs治疗基础上，联合新的直接抗病毒药物（DAA）或联合免疫调节剂，可能有助于减少HBV cccDNA池，达到功能治愈或临床治愈，即HBsAg的持续性消失和血清中HBV DNA低于检测下限，伴或不伴有HBsAg 的血清学转换。



临床上应用的另一类抗HBV药物是IFNα。有关IFNα对cccDNA作用的研究较少，且结论有所差异。Protzer团队报道高浓度IFNα作用于肝细胞可诱导脱氨酶APOBEC3A的表达促使cccDNA发生C→U突变形成去嘌呤或去嘧啶位点（AP位点）进而被细胞碱基切除修复机制识别而降解清除。在多项体外HBV感染模型中，发现IFNα在强烈抑制HBV转录和抗原表达的工作浓度下，对cccDNA含量无明显下调作用，提示IFNα对cccDNA的作用主要表现为抑制cccDNA转录活性，而非直接降解cccDNA。但临床研究的数据可能较为可靠。已有临床研究表明，IFNα治疗在部分患者中可致cccDNA一定程度降低，出现HBeAg血清转换的患者肝内cccDNA下降幅度总体大于未发生HBeAg血清转换者，相比NAs单药治疗，IFNα与NAs联用可更为有效地降低cccDNA。在长期NAs治疗的基础上，部分优势患者（HBeAg清除和HBsAg＜1500 IU/ml）联合或序贯PEG-IFNα治疗，CHB功能治愈率可达20%以上。对于非活动性HBsAg携带者，接受PEG-IFNα治疗后的功能性治愈率可达40%，PEG-IFNα治疗ALT升高与功能性治愈密切相关，提示PEG-IFNα治疗在体内通过诱导特异性免疫反应清除感染肝细胞而间接减少cccDNA的可能性。



复旦大学上海医学院的陈捷亮博士和袁正宏教授将结合自己的工作，就抗HBV治疗与CHB功能性治愈作详细的介绍。

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靶向HBV cccDNA的药物及生物技术



目前在新药研发管线（pipeline）中的抗HBV药物主要针对CHB功能性治愈。但最理想的药物无疑是对HBV cccDNA有直接作用的抑制剂，如靶向cccDNA形成、促进ccccDNA降解和刺激免疫反应杀伤感染肝细胞的药物，这些药物研发的目标是CHB的完全治愈。随着生物技术的进步和对HBV cccDNA特性的深入了解，以靶向清除cccDNA为目标的抗病毒药物的研发日益增多。主要包括：（1）靶向cccDNA的常用基因编辑技术，如锌指核酸酶）、转录激活因子样效应物核酸酶和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关（Cas）蛋白9 （CRISPR/Cas9）技术；（2）表观遗传学修饰靶向静默cccDNA，主要包括DNA甲基化和组蛋白修饰等。多项研究已证实表观遗传学修饰可调控HBV cccDNA转录，进而影响HBV复制，表明表观遗传治疗具有治疗CHB的潜力，为CHB的治疗开辟新途径；（3）靶向病毒蛋白负性调控cccDNA。病毒蛋白包括HBV x蛋白（HBx）和core蛋白在cccDNA的转录过程和维持cccDNA的稳定性中都发挥着重要作用。因此，除了直接靶向HBV cccDNA外，通过靶向这些病毒蛋白也能实现对cccDNA的调控（图1）。





图1  HBV的复制周期和抗HBV的靶位蓝色指间接靶向cccDNA的药物或技术；红色指直接靶向cccDNA的药物或技术



北京大学基础医学院的陈然、王杰博士和鲁凤民教授等将结合自己的工作，就靶向HBV cccDNA的药物及生物技术等作详细的介绍。





3  HBV cccDNA转录调控机制与抗HBV治疗前景



HBV cccDNA是病毒RNA转录的模板；在细胞核内，cccDNA通过与组蛋白、非组蛋白等结合以微染色体的形式存在，结构稳定且难以被清除。因此，cccDNA持续稳定存在被认为是HBV 持续感染、耐药以及抗病毒药物停用后HBV 再激活的最主要原因。表观遗传学是指不影响DNA序列的前提下基因功能可逆转、可遗传的改变，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA介导的基因表达改变等。其中，组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等，而其中甲基化和乙酰化是目前研究较为明确调控cccDNA转录活性的两种修饰。近年来随着高分辨质谱分析技术和生化实验手段的综合运用，除了传统的组蛋白乙酰化和甲基化，陆续发现近十几种新型组蛋白修饰类型，包括巴豆酰化、琥珀酰化、丙酰化、丙二酰化、丁酰化、2-羟基丁酰化、3-羟基丁酰化、戊二酰化。这些发现大大拓展了对组蛋白表观的认识，同时也将为cccDNA表观调控研究开辟新的领域。随着对cccDNA微染色体上组蛋白表观遗传修饰的逐步解析，表观遗传治疗也有望成为HBV新的潜在治疗方向。



重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室的陈娟和黄爱龙教授将结合自己的工作，就HBV cccDNA转录调控机制与抗HBV治疗前景作详细的介绍。





4  HBV cccDNA的体外细胞模型和实验小鼠模型



在过去的20年中，尽管在抗HBV治疗方面获得了令人瞩目的成就，但在CHB功能性治愈方面进展不大，对HBV cccDNA形成、维持和降解等代谢机制仍缺乏深入细致的了解。在HBV cccDNA相关研究中，合适的实验模型极其重要，主要包括：（1）HBV cccDNA体外细胞模型，如病毒感染细胞模型（又分为原代肝细胞模型和肝肿瘤细胞模型）、cccDNA从头合成的转染细胞模型和病毒复制子转染细胞模型（又分为线性复制子模型和HBV重组cccDNA模型）；（2）用于cccDNA研究的实验小鼠模型，如人肝细胞嵌合小鼠模型和实验小鼠模型、应用高压水动力注射的体内转染小鼠模型、基于重组病毒载体转导的小鼠模型等。



复旦大学基础医学院的苏瑜、朱园飞、田青右博士和谢幼华、邓强教授将结合自己的工作，就HBV cccDNA的体外细胞模型和实验小鼠模型的研究进展作详细的介绍。





5  原位杂交技术（ISH）在检测HBV核酸和cccDNA中的应用



ISH是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，能够在细胞和染色体水平上对特定核酸进行定量与定位，广泛应用于病毒学研究。ISH对于HBV中的核酸（RNA、复制中间体DNA），以及cccDNA的检测有着重要意义。袁正宏、张小楠教授团队改进了ViewRNA技术，在bDNA信号扩增技术基础上二次开发，成功建立了一种能在组织水平显示cccDNA分布的ISH。随后该团队又在前期工作基础上，在bDNA放大体系的最后一步改为荧光标记的Label probe，建立了一套荧光原位杂交技术，在HBV复制系统HepAD38及感染系统HepG2-NTCP中，使用3D-STORM和3D-SIM成像系统,获得了HBV RNA和DNA的图像，提高了空间分辨率，有助于进一步剖析HBV在宿主细胞内传播过程中的关键分子事件，并验证cccDNA维持和转录的关键表观调控因子。HBV荧光原位杂交技术的建立将帮助研究者深入探讨病毒感染、扩增周期中关键事件（cccDNA转录，pgRNA翻译与核衣壳包装、病毒成熟释放等）的分子机制，为鉴定病毒复制关键宿主因子、开发新一代抗病毒药物提供线索。



复旦大学附属上海市公共卫生临床中心的徐通博士和张小楠、 袁正宏教授将结合自己的工作，就 ISH在检测HBV核酸和cccDNA中的应用作详细的介绍。





6  HBV cccDNA定量检测方法进展



在CHB抗病毒治疗前、期间和之后监测cccDNA的变化，有助于判断患者的疗效以及是否出现停药复发。在研发新的抗HBV药物，尤其是靶向cccDNA药物的过程中，需要简便、敏感、特异的cccDNA检测试剂，但目前仍缺少高特异度和高灵敏度的cccDNA检测方法。



在进行cccDNA检测之前，非常重要的一步是从肝组织或肝细胞中抽提cccDNA，对于提高cccDNA检测的特异性至关重要。在肝组织中，每个HBV感染的肝细胞内cccDNA的水平稳定在5～50个拷贝，仅占总DNA中的极小一部分。此外，感染HBV的细胞中还有较多的rcDNA、双链DNA和单链DNA等，分离所有DNA(包括病毒DNA和染色体DNA)需要裂解细胞核释放总DNA，并去除蛋白质。比较常用的cccDNA提取方法有Hirt提取和试剂盒提取，前者步骤较为复杂却是经典的方法；后者操作更为简单。



常规的cccDNA检测主要是基于PCR方法，检测原理是利用cccDNA和rcDNA结构的差异进行设计。经典的PCR法通过跨正负链缺口设计引物探针特异性扩增cccDNA。但是这种cccDNA检测的方法并没有得到广泛的认可,主要是因为rcDNA产生的DNA重组和cccDNA占比极低等问题，导致基于PCR的cccDNA检测方法特异性不高，如在rcDNA浓度较高的情况下，引物自退火导致出现假阳性。



为解决这一难题，核酸酶被用于处理样本中的非cccDNA。最初开发的方法是应用PsD酶处理样本，以提高cccDNA检测的特异度，但仍然存在特异度不高的问题。最近，相对比较认可的方法是应用外切酶（Exo）Ⅰ&Ⅲ和T5核酸外切酶处理、消化抽提的cccDNA样本，具有较高的特异度。随着cccDNA检测特异度的提高，常常伴随cccDNA检测敏感度的下降。最近数字PCR被用于cccDNA检测，检测敏感度得到极大的提高。



复旦大学附属华山医院的江培学博士和毛日成、张继明教授将结合自己的工作，就HBV cccDNA定量检测方法进展作详细的介绍。





7  HBV cccDNA研究面临的挑战



目前，HBV cccDNA研究仍面临许多挑战，包括：

（1）HBV cccDNA在细胞核内的形成机制仍未完全明确，细胞内哪些酶参与了RcDNA向cccDNA形成过程？DSL DNA是否参与cccDNA形成及病理生理学意义也并不清晰。

（2）cccDNA的代谢动力学仍存在不一致的意见。cccDNA细胞核内稳定性特征相关的分子机制，以及宿主细胞是否存在特定的天然免疫机制清除cccDNA仍具有较大争议，代表了本领域重要的研究方向。

（3）表观遗传治疗药物通过沉默cccDNA转录，有望成为一种有效抗病毒的新策略。但如何筛选到高选择性、低毒性的表观遗传治疗药物？

（4）发展新型免疫治疗策略能否有效清除或沉默cccDNA的表达，实现HBV的（功能性）治愈。

（5）仍缺少理想的cccDNA研究的细胞和动物模型。

（6）临床上仍需要兼顾特异性和敏感性的cccDNA检测商业化试剂盒。相信随着科学的进一步发展，以上诸多问题终将得到解决，为最终治愈CHB奠定基础。

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长期治疗虽然可使肝内cccDNA总体水平逐渐降低，但不能完全清除cccDNA，最主要的原因可能是NAs不能彻底地抑制HBV复制。复旦大学袁正宏课题组利用接受阿德福韦长期治疗的CHB患者肝穿组织，进行原位cccDNA检测，发现患者的血清HBV DNA虽然低于检测下限，肝内HBV抗原水平和细胞浆HBV DNA水平大幅降低，但肝细胞核内仍可检测到一定水平的cccDNA。其他研究也报道，即使接受长达10年以上的NAs抗病毒治疗，且血清中HBV DNA水平持续低于检测下限，但肝组织中仍可检测到cccDNA。以上提示，尽管长期NAs治疗可使血清中的HBV得到抑制，但肝组织内仍存在低水平的HBV复制，没有完全切断cccDNA池的补充。在长期NAs治疗基础上，联合新的直接抗病毒药物（DAA）或联合免疫调节剂，可能有助于减少HBV cccDNA池，达到功能治愈或临床治愈，即HBsAg的持续性消失和血清中HBV DNA低于检测下限，伴或不伴有HBsAg 的血清学转换。