从病毒学角度谈慢性乙型肝炎的功能性治愈

newchinabok

【摘要】通过抗病毒治疗达到慢性乙型肝炎（CHB）的功能性治愈已成为国内外研究的热点和难点，近年来对其临床治愈的标准也基本达成了共识：血清HBV DNA低于检测下限，持续的HBsAg消失，伴或不伴抗-HBs血清学转换，肝细胞内cccDNA处于非活动转录状态，停止抗病毒治疗后没有疾病复发的情况。现有的抗病毒治疗方案能有效抑制病毒复制，但难以达到CHB的功能性治愈。从病毒学方面考虑，乙型肝炎病毒（HBV）cccDNA的转录活性不能得到有效的抑制及病毒基因组DNA的整合导致HBsAg的持续表达是CHB患者功能性治愈率较低的两大根本原因。此外，HBV独特的复制周期产生的高频突变也会导致表面抗原清除率的降低。本文将着重围绕病毒学方面的研究现状，探讨功能性治愈CHB的新进展和新策略。

【关键词】肝炎，乙型，慢性；功能性治愈；肝炎病毒，乙型；肝炎表面抗原，乙型；共价闭合环状DNA

【Abstract】Functional cure of chronic hepatitis B (CHB) through antiviral therapy is the goal and main focus of research worldwide. The criteria of functional cure of CHB are undetectable serum HBV DNA, persistent loss of HBsAg, with or without anti-HBs seroconversion, persistence of cccDNA in a transcriptionally inactive status and the absence of spontaneous relapse after treatment cessation. Current antiviral therapy can effectively control viral replication, but is still quite far from achieving functional cure. From the virological point of view, HBV cccDNA reservoir and its transcription activity can hardly be inhibited by the existing antiviral therapy, and the integration of viral genomic DNA leads to the continuous expression of HBsAg, which are the two main causes of the low functional cure rate in CHB patients. Furthermore, the high frequency of viral mutation can also result in a reduction of HBsAg loss. This article reviews the new strategies and advances about functional cure of CHB based on the virology research.

【Key words】Hepatitis B, chronic；Immunity, innate；Immunity, humoral；Adaptive immunity；Functional cure



乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）是一种威胁全球人类健康的病毒。根据已公布的统计数据推算，目前我国人群的HBsAg携带率约为6.1%，HBV感染者约8 600万[1]。慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患者发生肝硬化和肝癌的风险较高，对达到治疗标准的患者进行抗病毒治疗则能减缓疾病的进展并减少肝脏相关疾病的发病风险[2]。乙型肝炎的功能性治愈是目前国内外公认的抗病毒治疗的理想终点，本文将结合HBV复制的特点，着重围绕病毒学方面的研究，就CHB功能性治愈的定义、难点及其重要性等问题进行探讨。

一、CHB功能性治愈的定义

CHB真正意义上的完全治愈需要彻底清除所有被感染的肝细胞中的共价闭合环状DNA（cccDNA），并且能够在停止抗病毒治疗后不出现因机体失去免疫控制而产生病毒再激活和疾病复发的风险[3]。现有的抗病毒治疗方案很难做到彻底清除cccDNA，同时cccDNA只存在于被感染的肝细胞中，需要通过有创的肝活检才能加以检测，血清中缺乏明确的生物标志物来反映肝内的cccDNA的水平及其转录活性[4]。基于上述情况，有学者提出了“功能性治愈”的概念。目前，国际上较为公认的功能性治愈的定义是：血清HBV DNA低于检测下限，持续的HBsAg消失，伴或不伴抗-HBs血清学转换。肝细胞内cccDNA处于非活动转录状态，停止抗病毒治疗后没有疾病复发的情况[3]。近年来，临床治愈CHB，即实现功能性治愈已成为国内外抗病毒治疗较为可行的理想终点，并以此作为指导临床安全停药的标准。

二、HBV复制周期及其特点

HBV是一种独特的DNA病毒，其复制需要前基因组RNA中间体来完成。HBV感染肝细胞时，通过与肝细胞相关受体钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白（NTCP）结合并穿入细胞后释放核衣壳[5]，其基因组部分环状双链DNA即rcDNA进入细胞核，补齐双链缺口形成cccDNA[6]。HBV cccDNA与宿主组蛋白和非组蛋白结合形成病毒微染色体，具有高度稳定性[7]，作为转录模板产生3.5×103 bp的前基因组RNA和PreC mRNA，2.4×103 bp的PreS1 mRNA，2.1×103 bp的PreS2/S mRNA及0.7×103 bp的HBx mRNA[8]，分别编码聚合酶和核心蛋白，可溶性抗原，表面抗原大、中、小蛋白和HBx蛋白。前基因组RNA还可作为病毒逆转录的模板，通过与核心蛋白和聚合酶的结合，开始病毒的装配，并开始逆转录过程。

病毒聚合酶与前基因组RNA 5’端Epsilon环结合并以之为模板合成3～4个寡核苷酸，发生第一次模板转位到前基因组RNA 3’端的DR1上配对，沿3’至5’端方向合成负链DNA。延伸至前基因组RNA 5’端时，聚合酶会切除RNA并余10～16个核苷酸作为引物，发生第二次模板转位到负链DR2上，沿负链3’至5’端方向合成正链DNA。延伸至负链5’端DR1结构时发生第三次模板转位，跳转到环化负链的3’端DR1结构继续合成正链DNA，并最终形成rcDNA[9]。成熟的病毒颗粒获得包膜蛋白向胞外释放，一部分则会返回至细胞核中转变为cccDNA，保持一定数量的转录模板。

HBV感染的过程中还会产生病毒基因组DNA的整合，但这并不是病毒复制所必需的过程。当病毒复制过程中RNA引物的第二次模板转位失败，在原位引发正链合成，就会形成双链线性(DSL)DNA，在宿主细胞酶的作用下，病毒双链线性形式的DNA就会整合至宿主DNA中[10]。此前认为HBV基因组的整合与肝细胞肝癌相关[11]，现阶段研究发现，病毒的整合是一个随机事件，可发生在CHB感染的早期。与病毒感染的HBeAg阳性阶段相比，HBeAg阴性阶段发生的整合事件数量明显更多[12]。

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三、CHB功能性治愈的难点

国内外多推荐将功能性治愈作为CHB抗病毒治疗的理想终点，代表患者已获得持久的病毒学抑制和免疫学控制，但现阶段仍只有小部分CHB患者在接受抗病毒治疗后获得临床治愈，提高功能性治愈率可谓难点重重。从病毒学方面考虑，接受长期抗病毒治疗后，CHB功能性治愈率仍然较低的可能原因如下：首先，cccDNA存在微染色体中，难以被现有的抗病毒药物彻底清除，其具有转录活性并作为病毒持续复制的模板；其次，病毒基因组DNA整合至宿主DNA中，可持续产生HBsAg。



1.现有的抗病毒药物对HBV的清除作用



目前针对CHB有效的抗病毒治疗药物包括聚乙二醇干扰素（Peg IFN）及核苷（酸）类似物（NAs）[13]。这些药物通过免疫调节作用和直接抗病毒作用抑制病毒的复制，减轻肝脏的病理损害，但长期治疗后HBsAg的阴转率仍然较低[4]。NAs主要针对病毒复制的逆转录过程，能有效抑制病毒的复制，降低外周血病毒载量，对cccDNA没有明显的抑制效果[14]，长期治疗后血中的HBsAg下降亦不明显。因此，单用NAs不能有效达到功能性治愈CHB的目的。IFN作为免疫调节剂，能够产生多种抗病毒物质，其抑制病毒复制的效果不如NAs快和强，但较为持久，延长治疗时间则可能会带来更多的不良反应。根据长期随访数据显示，在接受IFN治疗后也仅有10%～13%的人群发生HBsAg的清除[15]。值得注意的是，在接受IFN治疗后，基因型为A型或B型的患者较C型和D型的患者有更高的HBsAg清除率[16]。有关联合使用Peg IFN及NAs是否能有效提高CHB功能性治愈率的意见尚不一致[17]，多数研究认为联合治疗比单药治疗在HBsAg清除方面有一定优势，但并未改善停药后的持久应答率，也有学者认为联合治疗并不能提高功能性治愈率[18-19]。



2.根据病毒复制特点寻找新的治疗靶点



现有的抗病毒治疗方案不能提供理想的功能性治愈率，所以有必要研发新的抗病毒药物，以提高功能性治愈率[20]。根据HBV独特的生活史，可从抑制HBV进入肝细胞，降解消除cccDNA或抑制HBV的产生，抑制HBsAg释放等过程寻找新的抗病毒治疗靶点[21]，以改善CHB人群的功能性治愈率[22]。

四、HBV cccDNA的表观遗传调控及其病毒学替代指标

CHB难以治愈的主要原因之一就是抗病毒治疗后无法有效清除作为病毒转录模板和基因组保存形式的cccDNA。获得临床完全治愈要求CHB患者肝细胞内的cccDNA被彻底清除，而获得功能性治愈的患者肝细胞内仍可以有cccDNA的存在，但必须处于非转录活性状态[23]。为了达到理想的功能性治愈率，对病毒cccDNA的控制显然是一项重要的研究议题。



1. HBV cccDNA的生物学特点



现有的研究发现cccDNA的半衰期较长，通过推算至少需要14.6年才能完全清除肝细胞内存在的cccDNA[24]，其在肝细胞内的持续存在是CHB久治不愈和停药后容易复发的主要原因[25]。HBsAg得到清除后，肝细胞内仍能检测到cccDNA的存在。在cccDNA形成后，Peg IFN能靶向抑制其转录机制，如转录因子和染色质修饰酶等，减少病毒蛋白和病毒颗粒的产生，所以部分患者使用Peg IFN能达到功能性治愈的目的[26]。



2. HBV cccDNA的表观遗传调控



实验证据表明，HBV cccDNA通过与宿主组蛋白和非组蛋白结合并得到修饰而稳定存在[24]，其表观遗传修饰有助于病毒的复制和感染的慢性化。表观遗传调控主要包括DNA的甲基化，组蛋白的翻译后修饰等。DNA的甲基化通常会导致基因的转录沉默状态，HBV cccDNA的甲基化会导致病毒基因表达下降[27]，这一过程可作为新的CHB抗病毒治疗策略。与HBV cccDNA结合的组蛋白通过翻译后修饰（PTMs）的各种组合可促进或抑制基因的表达，例如H4组蛋白精氨酸3的对称二甲基化（H4R3me2s）与转录抑制有关[28]，精氨酸甲基转移酶PRMT5可诱导与cccDNA结合的H4R3me2s，从而抑制病毒的转录活性，表明靶向cccDNA表观遗传治疗的可能性。

根据现有的研究结果，表观修饰对cccDNA的持续存在和清除过程发挥了重要作用。如果能通过表观修饰沉默cccDNA的转录活性，可作为控制CHB的一项手段，甚至能提高CHB的临床治愈率。



3. 反映肝内cccDNA及其转录活性的病毒学替代指标



由于肝细胞核内的cccDNA无法释放到血循环，在临床实践中，如何监测cccDNA的水平及其转录活性仍是一项重大的挑战。为了更好地了解患者在抗病毒治疗后是否获得功能性治愈，需要发现新的病毒学无创标志物来替代传统的肝活检检测cccDNA的手段[29]。血清中的HBsAg曾作为肝内cccDNA的替代标志物，但近期的研究结果发现，经过长期的NAs治疗后（均值126周），患者肝内cccDNA可被大量消耗并显著降低，有49%低于检测下限，而外周血中仍能检测到HBsAg的存在[26]，提示HBsAg并非反映肝内cccDNA情况的最佳病毒学标志物，原因可能是HBsAg可来自整合的HBV基因组DNA。

近期有不少病毒学指标被发现可能具有反映肝内cccDNA转录活性的价值，如血清HBV RNA。血清HBV RNA样病毒颗粒中主要是3.5×103 bp的前基因组RNA[30]。不同于HBsAg，由于病毒基因组DNA长度不超过3.2×103 bp，血清中的HBV RNA仅源自肝内的cccDNA，不能通过整合的HBV基因组转录所得，因此是反映肝细胞内cccDNA转录活性的良好标志物[31]。有学者还据此提出了从“部分治愈”，“准临床治愈”再到“临床治愈”的阶梯性提升模式[32]，对血清HBV RNA在功能性治愈中的应用价值进行了展望。

五、HBsAg与HBV基因组整合

HBsAg的清除是获得功能性治愈的另一个重要标准。乙型肝炎研究中最早被发现的就是HBsAg，也是HBV感染后最难清除的病毒蛋白，包括大、中、小三种类型[33]，除了形成具有感染性的丹氏颗粒（Dane颗粒）外，还组成大量的亚病毒颗粒，即管状或小球形颗粒[34]。其中HBsAg大蛋白和宿主细胞的NTCP受体具有高度亲和力，是病毒进入细胞重要的蛋白。乙型肝炎感染者的血清中以亚病毒颗粒为主，其数量远超Dane颗粒。既往研究认为，非感染性亚病毒颗粒的大量存在降低了病毒颗粒被HBsAg中和的机会，诱导免疫耐受，赋予了病毒生物学优势。鉴于HBsAg是宿主免疫应答清除病毒过程中的重要靶抗原的这一理论依据，国内有团队设计了HBsAg-HBIG复合物型治疗性疫苗“乙克”，以HBsAg为突破口，诱导患者的持久免疫，从而使cccDNA处于非转录活性状态，达到功能性治愈[14]。

近期有关HBsAg分子病毒学方面的研究让我们对其与cccDNA和整合的HBV基因组DNA之间的相互关系有了更深的理解[12]。血循环中的HBsAg既可来自cccDNA，也可来自整合的HBV基因组DNA。整合至宿主的病毒基因组片段缺少核心蛋白的启动子和增强子，不足以成为病毒复制的模板，但大部分整合的片段含有HBsAg的启动子区域，因此在cccDNA得到清除或受到表观修饰失去转录活性时，HBsAg仍能在细胞中进行表达[35]。研究显示，HBeAg阴性患者体内整合的DNA片段是HBsAg的重要来源，故经过长时间的抗病毒治疗，CHB患者血清HBsAg仍可持续阳性[36]。因此，达到HBsAg阴转需要同时清除cccDNA及整合的病毒基因组DNA或阻断其的表达。不难推测，发生病毒整合的患者清除HBsAg的可能性要比无整合者小很多，但整合来源的HBsAg表达并不意味着病毒在肝内的活跃复制，这对定义临床治愈和考虑HBsAg阳性的患者是否能进行安全停药是一个重要的问题。整合产生的HBsAg是否具有病毒学功能和致病性尚不明确，针对整合的片段进行治疗的必要性也是一个有待解决的议题。

六、HBV基因突变与HBsAg清除

HBV自身具有高度变异性，这些变异与抗病毒疗效之间的关系也是研究的热点之一。HBV PreS/S区的突变可改变HBsAg抗原表位，影响抗原抗体反应的亲和力和病毒颗粒的包装、分泌及感染性等。一项研究结果显示，HBsAg特定糖基化位点的突变可介导免疫逃避[37]，患者外周血呈现HBsAg和anti-HBs的共存。也有研究发现，HBsAg St123N的突变能够减少病毒的分泌，诱导HBsAg和抗体更强的免疫反应，加速HBsAg在体内的清除[38]。部分患者在经过治疗后出现了HBV PreS/S区的突变，表现为外周血HBsAg的阴转，但并不代表病毒的清除[39]，影响抗病毒疗效的评估。

目前，二代测序技术被广泛用于检测病毒变异体。一项研究运用了高通量测序技术分析了157例患者的病毒基因组序列，检测到具有BCP/PC变异体或更高病毒多样性的患者在接受长期NAs治疗后发生HBsAg阴转的概率更低[40]。因此，HBV感染达到功能性治愈的治疗策略也应考虑到患者的BCP/PC序列特异性。

七、小结

从病毒学方面考虑，由于HBV cccDNA不能通过现有的抗病毒药物抑制其转录活性，作为病毒持续复制的模板，导致现阶段CHB人群中的功能性治愈率较低。此外，病毒基因组DNA的整合能够表达HBsAg，导致绝大多数患者在抗病毒治疗后HBsAg的清除率较低，而这恰好是临床治愈的标准之一。CHB患者停药时HBsAg得到清除或达到功能性治愈，肝细胞肝癌的发生率显著降低[41]。因此，针对病毒的复制环节研发新的抗病毒药物迫在眉睫，有效的cccDNA病毒学替代指标也有待被发现和证实，使CHB患者通过有限的治疗更早清除HBsAg，提高功能性治愈率

newchinabok

所以RNAi+核衣壳+免疫药必不可少

SK蜗牛

回复 newchinabok 的帖子

RNAi+核衣壳+免疫药，前两种已经不需要在担心了，就是好的免疫药目前进展还很慢，干扰素是否可以代替免疫药呢？

newchinabok

SK蜗牛 发表于 2019-4-20 20:53
回复 newchinabok 的帖子

RNAi+核衣壳+免疫药，前两种已经不需要在担心了，就是好的免疫药目前进展还很慢 ...

干挠素可以一试，双免疫方案医药界也是认可的，不试不知道。问题是研发机构都没新开临床试验了，不知为什么，变得沉寂了

mingbai

其实加干扰素的研究不需要机构做了，中国已经在试验，也证明表抗低于100的效果很好，现在急切等待前2种药推出市面。

左罗

       “针对病毒的复制环节研发新的抗病毒药物迫在眉睫，有效的cccDNA病毒学替代指标也有待被发现和证实，使CHB患者通过有限的治疗更早清除HBsAg，提高功能性治愈率”。
       －－－－只是不知这些美好的治愈路径是否是作者的个人设想还是正在开展进行的临床试验研究？