APASL2019进丨徐东平团队的研究成果加深了对乙型肝炎病毒

newchinabok

APASL2019进展丨徐东平团队的研究成果加深了对乙型肝炎病毒特性的认识
原创： 徐东平  国际肝病  今天


编者按：在第28届亚太肝病学会年会（APASL2019）上，中国人民解放军总医院第五医学中心徐东平教授团队交流了五项研究结果，包括一个大会报告、一个分会报告和3篇壁报，研究结果明确了乙型肝炎病毒防治中临床关注的多个前沿问题，现与大家介绍分享如下。







徐东平教授

中国人民解放军总医院第五医学中心



1．验证鉴定了一种新型恩替卡韦（ETV）耐药突变



ETV是临床常用的一线核苷（酸）类似物（NA）之一，在NA初治患者中的耐药率很低，5年仅为1.2%，但在LAM耐药患者中，ETV治疗5年的耐药率可达到51%。乙型肝炎病毒（HBV）经典ETV耐药突变形式是在逆转录酶（RT）区发生LAM耐药突变rtM204V/M204I＋L180M（简称LAMr）后，再出现rtT184、rtS202或rtM250位点突变。近年Journal of Hepatology上发表的一篇论文报道在1名日本ETV难治性患者中检测到由rtA186T±rtI163V+LAMr耐药突变引起的ETV耐药（Hayashi S,…Tanaka Y, 2015），但此个案未见后续相关研究证实。



徐东平教授团队开展了此项研究，纳入了2007年至2016年在原中国人民解放军第三零二医院（现中国人民解放军总医院第五医学中心）接受耐药性检测的22,009例慢性HBV感染患者，其中6170例接受了ETV治疗。研究者结合病毒基因测序、表型分析和临床抗病毒应答随访资料分析，明确了经典ETV耐药突变以及上述报道的新型ETV耐药突变的临床检出率与突变形式特点，在14例患者中检测到rtA186T+LAMr突变，且与ETV应答不佳密切相关（图1）。突变毒株与野生毒株相比，对ETV的耐药敏感性下降超过200倍，证实了rtA186T（rtA186T+LAMr）是一种新型ETV耐药突变。但临床分析与实验研究并不支持rtI163V与ETV耐药相关。该项研究结果近日已在Antiviral Research杂志发表（Liu L,…Xu D, 2019）。





图1. 抗病毒治疗中rtA186T+LAMr突变株演变与治疗应答分析（6例代表性病例）



2. 发现鉴定了另一种新型ETV耐药突变



利用上述研究患者群体和研究方法，并结合计算机分子模建技术分析病毒突变对药物结合的影响，团队首次鉴定了rtA181C+LAMr是另一种新型ETV耐药突变。



该种突变共在18例有LAM耐药史的ETV治疗患者中检出，且与ETV治疗应答不佳密切相关。耐药表型分析表明，突变毒株与野生毒株相比，对ETV的耐药敏感性下降超过70倍（图2）。用定点突变消除rtA181C突变可回复病毒对ETV药物的敏感性。分子模建分析也表明该种突变可显著提高病毒逆转录酶活性区与ETV的结合能，引起结合的高度不稳定性（图2）。该种新型ETV耐药突变株与经典ETV耐药突变株均对替诺福韦酯（TDF）的敏感性无显著影响。



该项研究结果近日已在Emerging Microbes & Infections发表（Liu Y,…Xu D, 2019）。


APASL2019进展丨徐东平团队的研究成果加深了对乙型肝炎病毒特性的认识
原创： 徐东平  国际肝病  今天


编者按：在第28届亚太肝病学会年会（APASL2019）上，中国人民解放军总医院第五医学中心徐东平教授团队交流了五项研究结果，包括一个大会报告、一个分会报告和3篇壁报，研究结果明确了乙型肝炎病毒防治中临床关注的多个前沿问题，现与大家介绍分享如下。







徐东平教授

中国人民解放军总医院第五医学中心



1．验证鉴定了一种新型恩替卡韦（ETV）耐药突变



ETV是临床常用的一线核苷（酸）类似物（NA）之一，在NA初治患者中的耐药率很低，5年仅为1.2%，但在LAM耐药患者中，ETV治疗5年的耐药率可达到51%。乙型肝炎病毒（HBV）经典ETV耐药突变形式是在逆转录酶（RT）区发生LAM耐药突变rtM204V/M204I＋L180M（简称LAMr）后，再出现rtT184、rtS202或rtM250位点突变。近年Journal of Hepatology上发表的一篇论文报道在1名日本ETV难治性患者中检测到由rtA186T±rtI163V+LAMr耐药突变引起的ETV耐药（Hayashi S,…Tanaka Y, 2015），但此个案未见后续相关研究证实。



徐东平教授团队开展了此项研究，纳入了2007年至2016年在原中国人民解放军第三零二医院（现中国人民解放军总医院第五医学中心）接受耐药性检测的22,009例慢性HBV感染患者，其中6170例接受了ETV治疗。研究者结合病毒基因测序、表型分析和临床抗病毒应答随访资料分析，明确了经典ETV耐药突变以及上述报道的新型ETV耐药突变的临床检出率与突变形式特点，在14例患者中检测到rtA186T+LAMr突变，且与ETV应答不佳密切相关（图1）。突变毒株与野生毒株相比，对ETV的耐药敏感性下降超过200倍，证实了rtA186T（rtA186T+LAMr）是一种新型ETV耐药突变。但临床分析与实验研究并不支持rtI163V与ETV耐药相关。该项研究结果近日已在Antiviral Research杂志发表（Liu L,…Xu D, 2019）。





图1. 抗病毒治疗中rtA186T+LAMr突变株演变与治疗应答分析（6例代表性病例）



2. 发现鉴定了另一种新型ETV耐药突变



利用上述研究患者群体和研究方法，并结合计算机分子模建技术分析病毒突变对药物结合的影响，团队首次鉴定了rtA181C+LAMr是另一种新型ETV耐药突变。



该种突变共在18例有LAM耐药史的ETV治疗患者中检出，且与ETV治疗应答不佳密切相关。耐药表型分析表明，突变毒株与野生毒株相比，对ETV的耐药敏感性下降超过70倍（图2）。用定点突变消除rtA181C突变可回复病毒对ETV药物的敏感性。分子模建分析也表明该种突变可显著提高病毒逆转录酶活性区与ETV的结合能，引起结合的高度不稳定性（图2）。该种新型ETV耐药突变株与经典ETV耐药突变株均对替诺福韦酯（TDF）的敏感性无显著影响。



该项研究结果近日已在Emerging Microbes & Infections发表（Liu Y,…Xu D, 2019）。





图2. 对rtA181C+LAMr突变株的表型耐药分析与分子模建分析


图2. 对rtA181C+LAMr突变株的表型耐药分析与分子模建分析

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3. 对韩国研究团队新发现的TDF耐药突变进行了验证分析



TDF是否会引起HBV耐药突变长期以来未获得证实。在2017年AASLD会议上，韩国的一个研究团队首次报道了一种基于rtS106C+H126Y+D134E（简称CYE三联突变）的HBV四联突变（rtS106C+H126Y+D134E+L269I，简称CYEI四联突变）可引起患者对TDF耐药，近日该研究刚被Journal of Hepatology录用发表（Park ES,…Kim KH, 2019）。



徐东平教授团队的研究结果表明，在我国22,009例患者样本中，CYE三联突变检出9例，其中4例检出CYEI四联突变，这9例患者均未服用过TDF。对病毒的克隆测序表明，CYE三联突变和CYEI四联突变可以单独出现，也可与LAM或阿德福韦酯（ADV）耐药突变共存于病毒基因组。与野生株相比，CYEI四联突变株对TDF的敏感性并无显著降低，与ADV耐药突变共存时CYEI四联突变株对TDF的敏感性有10倍左右下降（图3）。上述结果表明，HBV CYEI四联突变不一定与TDF耐药直接相关。





图3. 对代表性HBV毒株的复制力及其对TDF敏感性的分析



4. 揭示了HBsAg阴性抗-HBc阳性者中肝组织HBV cccDNA等指标的特点



我国有约40%的人群曾经感染过HBV，但大多数为一过性感染，没有乙型肝炎发病史，表现为HBsAg阴性但抗-HBc阳性。近年来发现，应用利妥昔单抗等免疫抑制剂后，这些即往感染者发生HBV再激活的风险显著高于抗-HBc阴性的群体，为此认为这些即往感染者的组织内仍可能残留有HBV复制转录模板（HBV cccDNA），但目前对这个群体中肝组织残留HBV cccDNA的研究十分有限。



本研究纳入了100例HBsAg阴性但抗-HBc阳性研究对象作为实验组，20例慢性乙型肝炎患者和10例抗-HBc阴性的健康者分别作为阳性和阴性对照组，进行了肝组织总HBV DNA（tDNA）、cccDNA以及血清抗-HBc的定量检测。



结果表明实验组有22例检出了低水平的HBV tDNA，其中9例检出了cccDNA，并有2例检测出了低水平的HBV RNA；在22例HBV tDNA阳性组中，抗-HBc水平在cccDNA阳性亚组显著高于cccDNA阴性亚组。



以上结果证实HBsAg阴性抗HBc阳性群体中有部分为隐匿性HBV感染，抗-HBc定量检测有助于无创甄别这一群体中的隐匿性HBV感染的高风险个体。





图4. 肝组织HBV总DNA、cccDNA以及血清抗HBc水平的定量分析



5. 评价了核苷（酸）类拟物（NA）治疗中血清HBV RNA、HBcrAg和抗-HBc定量检测的临床意义



此项研究与北京大学医学部基础医学院鲁凤民教授团队合作完成。大多数NA长期治疗的慢性HBV感染患者可达到HBV DNA检测不到，但HBsAg持续阳性且水平下降缓慢，近年来血清HBV RNA、HBcrAg和抗-HBc定量指标被用于监测这些患者抗病毒疗效和停药复发风险。



本研究纳入了在原解放军第三零二医院接受长期NA治疗并定时随访的患者57例，中位数治疗时间为5.83（4.67, 7.75）年，每个患者取5个时间点采集的样本（共285份血清），同时定量检测了上述血清HBV指标。



分析结果表明，总体上在NA治疗期间，血清HBV RNA、HBcrAg、HBsAg和抗-HBc水平随着治疗时间延长而逐渐降低，其中HBV RNA和HBcrAg水平的下降与临床治疗的相关性较高，最终HBV RNA和HBcrAg分别在26例和6例（46%和11%）患者中达检测不到的水平。



研究揭示了这些血清病毒学指标在NA长期治疗患者中的临床相关性（图5）。该项研究结果近日已在Antiviral Therapy杂志发表（Liao H,…Xu D, 2018）。





图5. NA治疗中血清HBV DNA、HBV RNA、HBcrAg、HBsAg定量检测的临床意义示意图

hao12168

徐东平教授团队的研究结果表明，在我国22,009例患者样本中，CYE三联突变检出9例，其中4例检出CYEI四联突变，这9例患者均未服用过TDF。对病毒的克隆测序表明，CYE三联突变和CYEI四联突变可以单独出现，也可与LAM或阿德福韦酯（ADV）耐药突变共存于病毒基因组。与野生株相比，CYEI四联突变株对TDF的敏感性并无显著降低，与ADV耐药突变共存时CYEI四联突变株对TDF的敏感性有10倍左右下降（图3）。上述结果表明，HBV CYEI四联突变不一定与TDF耐药直接相关。