LNP：促进RNAi由理论到临床应用

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LNP：促进RNAi由理论到临床应用

来自药渡的雪球原创专栏
作者: 三七

导读：8月11日，美国FDA宣布首款小干扰RNA (siRNA)药物Onpattro (patisiran)上市，该药物曾获得美国FDA授予的突破性疗法认定、优先审评资格、快速通道资格和孤儿药资格。它的获批，不仅对患者和医生来说具有里程碑的意义，还将掀起一场制药行业的革命，是诺贝尔奖成果从概念走向实际治疗用途的一个光辉里程碑。而成功促使RNAi从论文走向临床实际应用的成功的载运技术应用——纳米脂质粒(lipid nanoparticle, LNP)，本文试从制剂的角度，概述LNP给药系统的设计及制备技术、肝脏及其它组织靶向性及未来前景等进行概述。


1RNAi的沿革

RNA干涉(RNA interference，RNAi) 是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA (double stranded RNA，dsRNA )时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象。这种现象发生在转录后水平，又称为转录了后基因沉默 (post transcriptional gene silencing，vrGs)

2006年瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁·法尔(Andrew Z Fire)和克雷格·梅洛(Craig Mello)，以表彰他们发现了“RNA干扰机制——双链RNA引起基因沉默”。诺贝尔奖评审委员会的公报中称：“他们的发现澄清了许多令人迷惑和矛盾的试验结果，揭开了大自然控制遗传信息传递的一种基本机制。他们开创了一个崭新的研究领域”。

可以说，这项突破性的技术，打开了一扇通往新天地的大门。这一创新的工作得到了许多生物实验室的青睐，也加速了生物学的发展。更重要的是，它让我们看到了通过“基因沉默”治疗疾病的希望。正如诺贝尔奖官方新闻稿中所说的那样，“RNA干扰已经在基础科研中得到了广泛的应用，能用以研究基因的功能。它还有望在未来带来全新的疗法。”

早在在诺贝尔奖颁发的5年前，2001年人类基因组草图的测序工作的完成，许多研究人员就开始在哺乳动物细胞里尝试应用RNAi，生物技术公司如雨后春笋般相继问世，争当第一款RNAi新药的发明人。



RNAi 技术发展的历程
1998：植物基因中基因沉默现象的发现
2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现
2001：被《科学》评为当年十大科技突破之一
2003：动物体内观察到RNA干扰作用
2004：在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展
2004：Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND
2004：siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND
2005：第一个RNA干扰药物进入一期临床，取得良好的效果
2005：化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破
2006：Andrew Z. Fire和Craig C. Mello因在RNA干扰领域的成就获得诺贝尔医学/生理学奖

2RNAi研究的困境

基因治疗早期研究方向侧重于通过传递DNA来诱导目标细胞表达特定的基因。但pDNA在小鼠全血(体外)中的半衰期仅为10 min，静脉注射后在体内的半衰期甚至更短，同时还有快速的肝积聚。所以核酸治疗的第一个主要障碍是血清核酸酶活性使得pDNA在血清中快速的消除。第二个障碍就是免疫刺激，这种免疫反应可以通过核酸的化学修饰部分规避,如mRNA和siRNA，但从生物来源纯化的pDNA(非全合成)，并不适合这种修饰。并且在生物纯化过程中也易受到原材料中热原(内毒素)的影响。后期的研究也更加集中在mRNA和siRNA

即使被经过大量修饰的核酸跨过了前两个障碍，它们仍然受到第三种障碍的影响——肾过滤(小于6nm的颗粒的高效过滤)。对寡核苷酸药动学的研究表明，50%以上的药物在尿液中排泄。为了提高核酸药物的生物利用度，已经进行了一些尝试，如通过右旋糖酐的硫酸盐等负电荷聚物等。虽然可以改善药代动力学特点，但仍然不能实现核酸在靶部位累积。即使实现了核酸的靶向问题，由于核酸的大分子结构(平均分子量为MW 13 kD)、高负电荷的物理化学的特点使其无法穿透细胞膜，被细胞内化后易被细胞内溶酶体降解的问题也依然存在。

潮水退后，裸露出来是石头，

也是摸着过河的石头

核酸类药物体内应用需要解决以下问题:

合理的设计基因序列及避免脱靶效应

避免血液及细胞内核苷酶的降解及免疫原性

给药系统递送siRNA分子进入靶细胞内

细胞内含体逃逸进入胞浆并实现RNAi

而如前所述通过生物信息学可有效设计siRNA序列，避免脱靶效应；通过核酸化学修饰的siRNA可避免核苷酶降解，降低免疫原性。但目前制约siRNA分子临床应用的瓶颈问题是给药系统及内涵体逃逸。

3用于递送核酸的LNP的设计

脂质纳米粒子(lipidnanoparticle,LNP)载运小分子药物的制剂技术已经相对成熟，目前全世界已批准9种脂质体药物制剂用于静脉给药，它具有适宜的粒径(100nm直径或更小)，高封装效率，制备工艺稳定、表面电荷低的特点(低表面电荷可以减少与血清蛋白的相互作用)。当通过不同的载药策略和制备技术配合，LNP载药系统可以实现核酸聚合物的有效聚集(> 80％)和递送，为了实现带负电荷的核酸的有效封装，则需要引入对RNA或DNA有很强静电结合力的阳离子脂质，这类阳离子脂质研发经历了如下所述经历了相当长的过程。

3.1 阳离子脂质和“lipoplexes”

早期开发LNP系统的主要努力方向是利用中性(两性离子)脂类的被动式包封法，如基于DOTMA的研发的复合物，将DOTMA与一种“辅助性脂”二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)结合在一起的“lipoplexes”，这种方法利用静电电荷吸引的方式来实现包封。但有包封效率较(<40％)、转染效力有限的，热力学不稳定的问题缺点，还有溶血、免疫原性。和其他毒性的缺点限制了它在活体实验的研究。

3.2 阳离子脂质和LNPs

第一代载运遗传药物(pDNA) 的LNP制备方案是采用阳离子脂质通过洗涤-透析的技术制备。该方法是将pDNA与阳离子脂质(DODAC)同OGP等表面活性剂混合，然后在OGP溶液中加入含卵磷脂和PEG-脂的溶液。最后的混合物被透析36-48小时，去除洗涤剂并形成纳米颗粒。当阳离子脂质含量为6~8 mol%时，包封率为30%，进一步用DOPE代替卵磷脂时，包封率可以达到70%。这些颗粒被称为SPLP (stabilizedplasmid-lipid-particles)，在低温透射电镜下呈单片状结构，粒径分布在70 nm左右。SPLP具有体内长循环特性，在小鼠中t1/2为 7小时。这使得2.5％的注射剂量在24小时内在远端肿瘤处积累，同时在肝脏和脾脏中水平非常低。重要的是，与Lipoplexes相比，SPLP的肝毒性明显降低，在30 mg DNA的剂量下Lipoplexes可使血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平增加100倍，而175 mg DNA的SPLP在血清中检测到ALT和AST的处在基线水平。然而，由于包封率低、效力有限以及洗涤剂透析制造技术是单一且不可扩展的原因，阻碍了SPLP方法的进一步前进。



3.3 离子化的阳离子脂质和乙醇载荷

洗涤-透析制备过程虽然可以生产均匀的LNP，但制备效率低下。因此，乙醇荷载工艺可以与可电离的阳离子脂质结合使用。最初的方法是用乙醇溶解脂质，并将该溶液加入到pH4缓冲液中的反义寡核苷酸(ASO)水溶液中。然后将产生的粒子挤出，得到均相的粒子群为100 nm的LNP，然后透析去除溶剂，中和pH值。该工艺包封率可以达到80%。随后开发了一种在T型管中混合的方法：先将脂质材料(包括阳离子脂及聚乙二醇脂(PEG脂))溶解于乙醇中，与核酸水溶液(pH4)进行混合，同样可得到直经<100nm的LNP系统。 后来又开发了更快速及可控的微流体(microfluidic)混合技术，得到了质量更好的LNP系统。所得粒子对ASO和pDNA系统的包封率分别高达90%和70%。

4Onpattro (patisiran)制剂概要

Onpattro是一种脂质复合物注射液(表1)，将siRNA包裹在脂质纳米颗粒(LNP)中，静脉输注后药物直接递送至肝脏细胞内，沉默hATTR mRNA的表达，减少产生hTTR蛋白，逐渐减少周围神经中淀粉样沉积物(hTTR)的积累，最终达到治疗疾病的目的。


在克服基因传递障碍中Alnylam Pharmaceuticals的给出的脂质纳米粒(LNP)方案中一项关键技术就是在LNP-siRNA系统中掺入了一种经过优化的离子化阳离子脂质(DLIN-MC3-DMA，简称MC3)。在LNP-siRNA系统中掺入MC3可带来高效的基因沉默效果，在小鼠模型中，在低剂量水平(5μg siRNA/小鼠 kg)下可有效地沉默小鼠肝脏中的基因。

采用离子化阳离子脂质的最初原因是为了实现在低pH条件下对带负电聚合物的有效包封，并且在pH7.4时也显示出相对无电荷的表面。然而，经静脉给药的LNP-siRNA系统对肝细胞基因沉默研究发现选用的离子化阳离子脂质至关重要。在进一步的进行全面的脂质筛选过程中，一个重要的原则就是，可离子化阳离子脂质必须有合适的pKa，只有足够高的pKa的LNP在内涵体酸性pH值下，阳离子脂质就能与内源性内质阴离子脂质结合，形成促进膜溶解的非双层结构，从而从细胞内的释放，但过高的pKa使得LNP在生理pH值下具有高的表面正电荷，可以吸附血清蛋白，并迅速从循环中清除。


在体内肝脏首次发现siRNA具有基因沉默活性的研究使用的是离子型阳离子脂1，2-二羟基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA，一种含有亚油酸酰基链的DODAP醚类似物)制备LNP，随后发现LNP的功能活性与所用阳离子脂种类特别相关，这引起广泛合成多种脂类物质的研究和评价，发现DLIN-KC2-DMA (KC2)作为离子化的阳离子脂质，效果优于与DLIDEMA，而MC3-LNP的ED 50进一步降低且毒性无增加，具备了临床应用的可能。

这种名为二油甲基-4-二甲基氨基丁酸酯(DLin-MC3-DMA，通常缩写为MC3)的脂，现在成为制备肝脏靶向siRNA/LNP系统用脂类材料的“金标准”。与用DLinDMA相比，用MC3制备siRNA/LNP给药系统后，肝脏组织细胞内的基因沉默活性显著提高三个数量级，而阳离子脂结构的变化对活性的影响相对较小。进一步研究发现，含有离子型阳离子脂质的LNPsiRNA系统就像乳糜粒脂蛋白(chylomicrons)一样，通过吸附内源性的ApoE，从而触发肝细胞表面的载脂蛋白(ApoE)受体摄取，达到进入肝脏细胞内的目的。

所以Alnylam Pharmaceuticals的采用MC3构建LNP-siRNA，用以静默由TTR基因突变以治疗遗传性运甲状腺素蛋白(TTR)介导淀粉样变引起的致命疾病。研究发现这一突变对含MC3的LNP-siRNA引起的基因沉默极为敏感。在一期临床中在0.5 mg siRNA/kg时人体耐受极好，而二期临床实验中0.3 mg siRNA/kg就可以收到很好的基因沉默效果，在2017年9月三期临床试验也取得了极佳的成果，达到了主要终点和所有次要终点。

5前景及展望

LNP-siRNA系统在肝细胞中沉默TTR基因的成功打开了一扇沉默肝细胞中的基因的大门，而几乎任何疾病都可以通过沉默病理性基因、表达有益蛋白或编辑有缺陷的基因来治疗。但未来其他的应用不仅仅局限于肝脏细胞，使用LNP系统可以沉默肝脏以外的组织中的基因，如沉默致癌基因，治疗诸如癌症的疾病。另一方面，LNP技术的延伸到递送mRNA为治疗性蛋白质的表达提供可能，可以治疗各种需要蛋白质替代的疾病。最后，扩展CRSPR-CAS在体内进行基因编辑的可以治疗许多遗传病。其中一些目前正在临床试验中进行评估(表2)。


5.1 肝外靶区LNP-siRNA的设计

LNP siRNA给药系统靶向肝外组织 LNP siRNA药物在肝细胞中有许多潜在的临床应用价值，由ApoE介导的脂蛋白颗粒的摄取也可发生在脑等其它组织中。由于存在血脑屏障，低密度脂蛋白(LDL)中的胆固醇不能到达大脑。因此，大脑合成自己的胆固醇，并利用ApoE将胆固醇转运到神经元，通过ApoE介导的内吞作用(类似于肝细胞)进行摄取。已经证明，在肝细胞中具有基因沉默有效性的LNP siRNA系统，经大脑皮层内给药后在神经元中具有相同的基因沉默有效性，需要通过脑室及脑鞘内内给药实现注射部位周围的沉默。一项关于LNP-siRNA介导的基因敲除实验中，实现了对SLC26A11的抑制，显著减轻了神经元肿胀。这些研究证实LNP-siRNA具有靶标识别的潜力，以及通过鞘内、室间或鞘内途径直接给药的治疗严重神经退行性疾病的应用潜力

5.2 用于基因表达和编辑的LNP设计

研究表明，乙醇负载LNP siRNA系统制剂制备技术及设施同样适用于制备生产LNP mRNA和LNP质粒(pDNA)系统。目前，已经开展了大量优化载运mRNA的离子化的阳离子脂质的的的研发，如静脉注射含有未经修饰的、编码促红细胞生成素(EPO)的序列工程mRNA-LNP，在猪和猴上实验都可以升高Epo水平，增加网织红细胞数，并提高红细胞压积。这说明了利用肝脏作为生物反应器表达治疗蛋白的可能性。

以这种方式使肝脏作为生物反应器为多种疾病治疗开辟了新的途径，LNP-mRNA系统在“主动”免疫方面的潜在应用。皮下、肌肉或皮内注射含有编码多种传染病相关蛋白抗原mRNA的 LNP系统，导致啮齿类动物和非人灵长类动物完全免受寨卡病毒感染的疾病的影响，在临床前模型中产生了令人印象深刻的免疫应答。

LNP-mRNA也显示出作为疫苗的潜在应用可能。Kranz等人研究表明LNP-mRNA在树突状细胞免疫治疗中，可以诱导DC细胞中抗原的表达。此外，还可以在黑色素瘤、结直肠癌和肺癌模型中诱导了强烈的抗肿瘤反应，还具有很高的安全性和耐受性。Yin等人利用LNP-CRISPR技术靶向小鼠的PCSK9基因治疗高胆固醇血症，在一次注射后可以将小鼠的胆固醇降低30~40%。

5.3 未来

继第一代小分子药物、第二代蛋白类生物药之后，第三代“智能”纳米药物将最大限度地利用生物体内过程，实现体内应用的高度靶向性，降低对人体的毒副作用。显然，含有核酸药物的LNP系统将在这一进化中扮演重要角色。一个显著的新特征是开发了能够 “包裹”带负电荷的大分子siRNA的LNP给药系统。LNP给药系统在体内能递送更大分子量的mRNA 及质粒DNA发挥生理功能，可能允许治疗许多基因突变引起疾病所需的精确基因疗法付诸实施。此外，除了有效负载核酸药物外，LNP系统可包含多种可修饰的组分，类似提供了一个相当大的工具箱，可最大程度地发挥负载药物的效力及降低药物的毒副作用。

值得注意的是，通过目前的LNP系统更多的依赖于“自然”靶向过程，如靶向肝细胞的ApoE依赖的内吞途径、或纳米粒子对免疫细胞的天然靶向，而不是利用配体靶向。此外，LNP RNA，或DNA制剂体内应用时机体，其中聚合物产生的免疫应答反应；以及在肝脏外的其它组织中如何发挥siRNA、mRNA、及DNA的作用的问题都值得关注。

采用LNP给药系统使得Onpattro成功上市，必将在全世界范围内推动 siRNA药物给药系统及siRNA药物开发的研究热潮。

参考文献：

[1] Kulkarni J A, Cullis P R, van der Meel R.Lipid Nanoparticles Enabling Gene Therapies: From Concepts to ClinicalUtility[J]. Nucleic Acid Therapeutics,2018,28(3):146-157.

[2]季爱民，韩军首款siRNA药物Onpattro的制剂学概述

[3]朱兴全, 陈宁, 周鹏. RNAi-生命科学的又一重大发现:2006年诺贝尔生理学/医学奖介绍[J].热带医学杂志, 2007, 7(1):1-2.

作者：三七


作者：药渡
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