长期NAs抗病毒治疗以使cccDNA池彻底耗竭和临床病毒学治愈带

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[size=59.2889px]APASL2019中国之声丨研究基础与临床复杂性---从概念出发

第28届亚太肝病研究学会年会（APASL2019）正在菲律宾马尼拉火热召开。在今天的Late Breaking Abstracts - Oral Research Presentation环节，北京大学医学部基础医学院鲁凤民教授团队有两项研究入选。这两项研究也是鲁凤民教授团队分别与解放军第五医学中心赵景民教授、德国Hamburg-Eppendorf大学医学中心Maura Dandri教授，以及与北京大学人民医院魏来教授、中国医科大学附属盛京医院感染科窦晓光教授和美国Baruch S. Blumberg研究所的郭巨涛教授合作开展的成果。研究成果介绍如下，希望在帮助大家加深对乙肝疾病认识的同时，也能引发对乙肝基础和临床研究的思考。




乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染可引起急慢性病毒性肝炎、肝硬化及失代偿性肝硬化和肝癌，是严重危害人类健康的全球性公共卫生问题。共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）携带HBV复制所需的全部遗传信息，可在静止状态肝细胞的细胞核中长期稳定存在，是HBV持久复制和建立持续感染的重要根源。



HBV复制具有独特的逆转录过程，即在新组装的核衣壳内，病毒p蛋白以转录自cccDNA的前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）为模板首先合成病毒DNA的负链，进而再以负链为模板合成正链。正链短于负链，且正、负链均不闭合，因此称为松弛环状DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）。含有rcDNA的核衣壳获得病毒外膜并释放入血，形成子代病毒，或核衣壳内的这些从头合成的rcDNA再进入细胞核，补充cccDNA池。



核苷（酸）类似物（nucleos(t)ide analogues，NAs）是目前临床上应用最广泛的抗HBV药物，该类药物可以显著抑制病毒的复制并阻滞疾病进展。已知NAs作用的主要机制是在病毒p蛋白介导的病毒DNA合成过程中，与天然核苷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的同类物竞争，掺入正在合成的HBV DNA链中，使得新链延伸合成被提前终止，从而抑制病毒基因组DNA的复制。NAs的掺入将导致新合成DNA链的不可逆终止，产生负链DNA长短不一的子代“病毒”。理论上讲，这些子代病毒应缺乏感染性，但目前尚缺乏直接的实验证据。



此外，并非所有的慢性HBV感染者在NAs治疗过程中都能获得良好的病毒学应答。在临床实践中人们注意到，那些有明显肝脏炎性损伤的慢性乙肝患者往往更能够获得良好病毒学应答，这提示除了病毒学因素外，宿主针对HBV病毒感染的反应也发挥着至关重要的作用，但其具体机制并未完全阐明。



本次报告的两项研究分别针对上述两个问题开展。来自鲁凤民教授团队的在读博士研究生闫颖和刘永振同学分别代表合作团队进行了口头报告。

研究一  增殖肝细胞的NTCP膜表达水平降低以抵抗HBV感染

既往人们已经注意到，在急性HBV感染的病毒快速清除以及慢性HBV感染的持续炎症过程中，天然免疫和适应性免疫可以通过不同方式清除病毒。一方面，免疫系统可以直接降解cccDNA，以非杀伤宿主细胞的方式清除病毒；另一方面，CD8+ T细胞通过直接杀伤HBV感染的肝细胞来清除病毒。后者往往会引发肝细胞的代偿性增殖。近来有研究利用人肝细胞嵌合小鼠模型，通过对HBV感染的人肝细胞的二次移植和诱导分裂增殖实验发现，人肝细胞中的cccDNA会随着肝细胞的增殖过程被不断稀释甚至丢失，从而产生cccDNA清除的新生肝细胞，据此认为这有助于cccDNA的清除和HBV感染的控制。但是处于增殖状态的肝细胞是否对HBV感染抵抗，目前尚未见详细报道。



钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白（sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP）是HBV进入肝细胞的受体，其表达水平与HBV感染密切相关。鲁凤民教授与赵景民教授和Dandri教授的合作研究发现，在肝细胞处于增殖状态时，NTCP的膜表达水平降低，使得增殖状态肝细胞对HBV感染抵抗，这也是加速HBV清除的重要机制之一。



他们在体外细胞实验中发现，将HepG2-NTCP细胞阻滞在G0/G1期后，NTCP膜表达水平升高，HBV感染效率提高。在HBV感染的人肝嵌合小鼠体内，仅在大多数人原代肝细胞停止增殖、NTCP蛋白质的细胞膜表达水平恢复正常后，HBV再感染才得以发生。进一步的临床研究结果显示，肝组织炎症活跃度更高的慢性乙型肝炎患者NTCP多呈低表达，这一特征可能有助于患者在抗病毒治疗时获得更好的病毒学应答。



这提示我们，在急性HBV感染的病毒快速清除以及慢性HBV感染的炎症过程中，存在持续的肝细胞死亡及残存肝细胞的代偿性增殖，一方面导致了cccDNA的不断稀释和丢失，产生更多无cccDNA的新生肝细胞；另一方面，由于处于增殖状态的肝细胞NTCP蛋白质膜表达水平降低，使其对HBV感染抵抗。两个因素共同作用，有助于HBV的控制和清除。







[size=59.2889px]原文链接：Down-regulation of Cell Membrane Localized NTCP Expression in Proliferating Hepatocytes Prevents Hepatitis B Virus Infection. APASL2019, Manila. oral presentation. Abs  研究二  核苷（酸）类药物作用下产生的HBV子代病毒因DNA链不可逆终止而缺乏感染性

抗病毒时代以来，核苷（酸）类药物（nucleos(t)ide analogues，NAs）被广泛应用于慢性乙型肝炎的治疗。NAs作用的主要机制是与天然核苷酸竞争性掺入正在合成的HBV DNA链，从而导致从头合成（de novo synthesis）HBV DNA链延伸的终止和HBV病毒基因组合成被抑制。



为了探究NAs治疗下子代“病毒”颗粒的感染性，该研究使用恩替卡韦（ETV）处理能稳定产生HBV病毒的HepAD38细胞，收集上清中的HBV病毒颗粒并体外感染HBV易感细胞系HepG2-NTCP，研究NAs作用下HBV子代病毒的感染性。结果显示，NAs作用下子代HBV DNA病毒颗粒缺乏感染性。进一步的体外病毒DNA链延伸实验证实，ETV的掺入导致子代病毒颗粒内新合成病毒DNA链的不可逆终止。



前期鲁凤民教授和窦晓光教授的合作研究已经证实，NAs作用下产生的HBV RNA病毒样颗粒也不具有感染性。NAs作用下子代HBV DNA病毒颗粒和HBV RNA病毒颗粒都缺乏感染性，支持了现行的对高病毒载量孕妇孕晚期NAs抗病毒治疗阻断HBV感染母婴垂直传播措施。此外，该研究也将为通过NAs治疗预防肝移植后病毒复发和阻断HBV感染水平传播提供新的思路。







原文链接：HBV virions produced under nucleos(t)ide analogues treatment are not infectious due to irreversible DNA chain termination. APASL2019, Manila, oral presentation. Abstract #1052.

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上述两项研究为NAs治疗慢性乙肝的快速应答机制提供了更为全面的解释：一方面，肝细胞的代偿性增殖可导致cccDNA不断的稀释和丢失，以及增殖状态肝细胞的NTCP膜表达水平降低导致其对HBV再感染抵抗。另一方面，NAs治疗下的子代“病毒”感染性的缺失进一步使HBV在细胞间的传播和cccDNA的形成减少，同时子代病毒DNA不可逆终止不能继续延伸，切断了cccDNA池的内补充途径，也加速了cccDNA的耗竭。



综上，上述两项研究为坚持长期NAs抗病毒治疗以使cccDNA池彻底耗竭和临床病毒学治愈带来了新的希望。但是，我们需要明白，显著不同于基础研究的大胆推理与小心求证，临床更加错综复杂，从概念到实践往往有很远的路要走

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这两项研究也是鲁凤民教授团队分别与解放军第五医学中心赵景民教授、德国Hamburg-Eppendorf大学医学中心Maura Dandri教授，以及与北京大学人民医院魏来教授、中国医科大学附属盛京医院感染科窦晓光教授和美国Baruch S. Blumberg研究所的郭巨涛教授合作开展的成果

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NAs治疗下的子代“病毒”感染性的缺失进一步使HBV在细胞间的传播和cccDNA的形成减少，同时子代病毒DNA不可逆终止不能继续延伸，切断了cccDNA池的内补充途径，也加速了cccDNA的耗竭。

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核衣壳抑制剂联合核苷药，可以预见加速这一进程

齐欢畅