乙肝“治愈”路】提高慢性乙型肝炎功能性治愈率的新方

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乙肝“治愈”之路】提高慢性乙型肝炎功能性治愈率的新方法和新策略
原创： 编辑部  中华临床感染病杂志  8月14日





文章来源

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章晓莉,贾红宇,蔡欢,杨益大.提高慢性乙型肝炎功能性治愈率的新方法和新策略[J]. 中华临床感染病杂志,2018,11(4):254-260.

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2018.04.002.


【摘要】慢性乙型肝炎（CHB）是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的以肝脏反复炎性病变为主要特征的疾病，可进一步发展为失代偿期肝硬化、肝癌或肝衰竭。目前CHB的抗病毒治疗药物主要是核苷（酸）类似物和干扰素两大类，虽能有效抑制病毒复制，但由于不能破坏共价闭合环状DNA（cccDNA），仍面临HBsAg清除率低、停药后易复发等问题，难以实现功能性治愈（或临床治愈）。新型药物及生物制剂的兴起为CHB实现功能性治愈提供新的思路和方向。本文就CHB功能性治愈的新方法及方案作一阐述。

【关键词】肝炎，乙型，慢性；肝炎病毒，乙型；功能性治愈；新方法

【Abstract】Chronic hepatitis B (CHB), characterized by recurrent liver inflammation caused by hepatitis B virus(HBV), can further develop into decompensated liver cirrhosis, liver cancer or liver failure. The currently used therapeutic drugs nucleos(t)ide analoguesand interferon can effectively inhibit virus replication, but it is difficult to achieve functional cure (clinical cure) because of their inability to destroy covalently closed ring DNA (cccDNA). So we are still facing  problems of low HBsAg clearance rate and high recurrence rate after drug withdraw. In recent years, the emerging of new drugs and biological agents provides novel ideas and directions for the functional cure of CHB. This article briefly reviews the new therapeutic methods and strategies for functional cure of CHB.

【Key words】Hepatitis B, chronic；Hepatitis B virus；Functional cure；New methods



    慢性乙型肝炎（CHB）仍是全球性公共卫生疾病，可进一步发展为肝硬化、肝癌或者肝衰竭，故需积极采取措施来降低CHB进展风险[1-2]。而CHB理想的治疗终点是其功能性治愈（临床治愈），即在有限的治疗疗程后，HBsAg、HBVDNA持续不可测，伴或不伴有抗-HBs产生，随着时间推移，肝脏组织病变改善，肝癌发生率减低（不同层次的功能性治愈包括完全阻断cccDNA转录、消除cccDNA、完全解决肝损伤和消除肝癌的风险）[3]。目前CHB抗病毒治疗药物主要是核苷（酸）类似物（NAs）和干扰素（IFN）[4]。NAs中短期治疗（1～5年）可明显降低HBV DNA水平，但HBsAg清除率只有3%～11%，且停药后易复发。而IFN疗程有限，且不良反应多，HBsAg清除率仅达10%[5]。因此，CHB的功能性治愈仍是个严峻的挑战。

    鉴于NAs及IFN单一治疗治愈率较低，抗病毒联合免疫调节治疗已成为当前国内外CHB治疗的主要研究方案。国家“十二五”科技重大专项——抗病毒/免疫调节治疗提高HBsAg阴转率新方案的研究显示，治疗48周后，IFN联合NAs、集落刺激因子及乙型肝炎疫苗治疗的CHB初治患者HBsAg阴转率达10.0%[6]，而NAs经治的CHB患者HBsAg阴转率高达15.83%，明显高于单一IFN或IFN联合NAs治疗。本文将对CHB治疗的新方案，包括针对直接抗HBV新靶点相关药物以及调节患者免疫状态相关生物制剂作一概述。

一、直接抗病毒治疗

1.HBV入胞抑制剂



    HBV进入肝细胞是HBV与宿主相互作用的第一步，由包膜蛋白介导，而前-S1结构域是受体结合的关键部位。李文辉团队在研究中发现钠-牛磺胆酸盐共转运多肽（Na+/taurocholate cotransporting polypeptide, NTCP）是HBV感染肝细胞的功能性受体，能够与前-S1区受体结合点特异性结合，从而介导HBV“入胞”[7]。故NTCP是阻断HBV进入肝细胞的理想靶点，而靶向NTCP药物被称为HBV入胞抑制剂。因此，HBV入胞抑制剂可能阻止非感染肝细胞中的cccDNA从头合成，在预防母婴传播或肝移植后再感染方面可能比清除慢性HBV感染者体内的HBV更有效[3]。Myrcludex B是不可逆NTCP阻滞剂，已被证明能有效防止HBV在体内及体外的传播[8]。有研究表明，40例HBeAg阴性CHB患者（HBV DNA＞2 000 IU/mL且无肝硬化）分别接受0.5、1、2、5、以及10 mg剂量的Myrcludex B治疗24周，最大剂量10 mg治疗组在12周后HBV DNA下降超过1 lgIU/mL，明显高于其他治疗剂量组，且有55%实现丙氨酸转氨酶（ALT）复常，但HBsAg的血清学水平没有明显改善[9]。尽管NTCP阻滞剂对于已存在的感染效果欠佳，但联合NAs、IFN或者其他制剂可能是未来CHB治疗的方向。



2.靶向cccDNA治疗



    清除cccDNA是CHB治疗的中心障碍，新的cccDNA合成可以被NAs抑制，但对于已经存在的cccDNA则难以清除。理论上，靶向cccDNA治疗可以清除、降解cccDNA或使cccDNA功能表达受阻，然而该领域的努力仍处于初级阶段。



2.1 嵌合核酸内切酶


    研究发现，在核酸内切酶上添加一个能与cccDNA序列特异性结合的DNA锚链多肽，可形成嵌合核酸内切酶，能在不影响宿主细胞DNA的前提下靶向识别并剪切cccDNA上的碱基序列。目前研究最多的是锌指蛋白核酸酶（Zinc-finger protein nucleases, ZFNs）、转录激活因子样效应核酸酶（Transcription-activator-like effectors nucleases，TALENs）、RNA介导的短回文重复序列（the RNA-guided clustered regulatory interspaced short palindromic repeats, CRISPR）以及CRISPR相关蛋白（CRISPR associated protins, Cas）核酸内切酶[10]。ZFN二聚体可以与HBV DNA互补，从而破坏复制。Cradick等[11]在研究中首次证明ZFNs可以在病毒复制的细胞培养模型中破坏36%的质粒衍生的病毒序列。随后Weber等[12]利用腺病毒载体转导表达HBV特异性ZFNs，并在细胞模型中检测其活性，结果发现ZFNs能有效抑制HBV DNA复制。另一种核酸内切酶TALENs利用可识别HBV特异位点的DNA结合域将移码突变引入HBV基因，从而抑制HBV DNA复制。Bloom等[13]报道TALENs可靶向识别S或C开放阅读框，导致35%的cccDNA分子突变。在体外研究中，靶向HBV DNA保守区的TALENs能够显著降低病毒蛋白、前基因组RNA和cccDNA的水平[14-15]。而CRISPR/Cas采用针对DNA保守区域的序列特异性的靶向RNA，引导核酸酶在此位点切割DNA，从而特异性破坏HBV cccDNA[16-18]。Kennedy等[19]在体外试验中发现CRISPR/Cas核酸内切酶能使肝细胞内的HBVDNA降至1/1 000，而肝细胞核内的cccDNA降至1/10。虽然临床前研究显示嵌合核酸内切酶能有效降解cccDNA，但其具体疗效需进一步深入探讨研究。



2.2 松弛环状DNA（Relaxed circular DNA, rcDNA）-cccDNA转化抑制剂


    Cai等[20]通过研究筛选出两种磺胺类衍生物，即CCC-0975以及CCC-0346，可抑制rcDNA向cccDNA转化，而且可以针对cccDNA控制表观遗传，同时证明CCC-0975可降低HBV感染的鸭原代肝细胞中的cccDNA合成。然而上述药物均在早期研究阶段，具体疗效尚需更多体外及体内试验进一步评估。



2.3 RNA干扰（RNA interference, RNAi）靶向抑制HBV基因表达


    RNAi可以直接高度特异性地靶向HBV mRNA转录，明显减少包括HBsAg在内的病毒蛋白的产生。ARC-520由两个合成的短干扰RNAs与胆固醇组成，靶向HBV RNA保守序列从而降低HBV DNA及病毒蛋白水平[21]。Wooddell等[22]在临床试验中让长期服用恩替卡韦的CHB患者分别接受不同剂量的ARC-520（最高达4 mg/kg），发现HBeAg阴性队列中接受4 mg/kg剂量的患者HBsAg下降明显高于其他剂量组；而在接受ARC-520相同剂量情况下，HBeAg阳性患者HBsAg下降较HBeAg阴性患者明显，同时在试验中证明ARC-520具有良好的耐受性，无严重的不良反应。Michler等[23]研究显示，表达短发夹RNA的腺病毒载体（Short hairpin RNA-expressing adeno-asociated-virus vector, AAV-shHBV）可针对HBV转录中常见的3’端，进而抑制病毒转录及蛋白表达，而用新的腺病毒8载体可获得持久的HBV抑制。N-乙酰半乳糖胺偶联siRNA（N-acetylgalactosamine-coupled siRNA, GAlNAc-siRNAs）通过肝细胞特异性唾液酸糖蛋白受体干扰基因的表达。研究表明，AAV-shRNA和GAlNAc-siRNAs均能抑制HBV抗原的表达，并发现两者在高病毒载量小鼠模型中能够促进治疗性疫苗诱导特异性CD8+T淋巴细胞的免疫应答作用，引起HBsAg及HBeAg血清学转换，实现功能性治愈。而且，部分小鼠甚至在停药5个月后仍能抑制HBV复制，同时无明显的不良反应[24-25]。ARB-1467能够降低 HBV所有转录物及抗原，同时具有较好的安全性和耐受性。而AB-452能降低HBV RNA稳定性。Mani等[26]研究表明，AB-452可以降低HBV RNA水平，且对HBV基因型A～H均有效。联合下文将提到的AB-506，以及ARB-1467和NAs能产生明显的协同抗病毒作用。AB-729是在ARB-1467基础上改善而成的一种新型RNA干扰剂，对HBV基因型A～H均有活性，单次皮下注射可抑制病毒复制并减少病毒转录，从而降低HBsAg水平。然而，其效应具有剂量依赖性，且目前具体疗效仍处于临床前研究阶段，需要进一步的数据支持[27]。ARO-HBV可靶向cccDNA及整合DNA产生的所有HBV转录物。研究表明，其在小鼠及食蟹猴属中具有良好的耐受性，每3周剂量可达300 mg/kg。单次剂量注射可长久降低高病毒载量小鼠模型中的HBV RNA、HBsAg、HBeAg以及血清HBV DNA水平，且重复皮下注射的疗效较单次剂量更佳，并与恩替卡韦具有协同抗病毒作用。虽然上述药物大多仍在临床前研究阶段，但为CHB治疗提供了新思路，亦启示我们未来CHB治疗可能需要多种药物联合使用[28]。

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2.4 基因沉默


    DNA的表观遗传修饰可以沉默基因的表达，是宿主防御病毒基因表达的机制。目前已经证实HBx可通过降解染色体的结构维持（Structural maintenance of chromosomes, Smc）5/6限制因子，从而抑制cccDNA转录和病毒复制[18,29]。



2.5  cccDNA降解


    载脂蛋白B mRNA 编辑催化多肽（Apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like, APOBEC）可与HBV核心蛋白相互作用，并转位到核心蛋白上脱氨基后降解细胞核内的cccDNA。最近Lucifora等[30]报道淋巴毒素β-受体（Lymphotoxin-β receptor，LTβR）激动剂可上调APOBEC，从而诱导cccDNA降解，体内与体外试验均表明LTβR可降低HBV DNA水平以及cccDNA浓度，但是其活化持续时间超过1年可能与肝癌的发展有关，因此LTβR激动剂仍需长期治疗相关的临床数据[16]。



3.HBV组装过程中相关靶点药物



    HBV核心/衣壳蛋白/HBc蛋白作为直接抗病毒的靶点近年来得到了广泛关注。目前研究较多的苯基丙酰胺（如AT-61，AT130）、杂芳基二氢嘧啶（Bay41-401）及磺胺甲酰胺衍生物可抑制前基因组RNA（Pregenomic-RNA, pgRNA）包封或衣壳形成，使逆转录产生无功能的病毒颗粒[31]。新型衣壳蛋白抑制剂NVR3-778在Ia期试验中没有发生治疗或剂量相关的不良反应[16]。Klumpp等[32]在人源化肝脏小鼠中发现NVR-778可降低血清中HBV DNA和RNA水平，并且与聚乙二醇干扰素（Peg IFN）的联合使用抗病毒效果更佳。然而其剂量相关的安全性、药代动力学仍在Ib试验期[16]。AB-506作用于核心蛋白二聚体界面，能够导致合成的衣壳缺乏pgRNA，从而阻断rcDNA形成,能有效抑制HBV复制，并可针对HBV的所有基因型。研究表明AB-506在高病毒载量小鼠模型中能降低血清HBV DNA水平，且其效应具有剂量依赖性。在耐受范围内（最高可达100 mg/kg），AB-506剂量越高，HBV DNA水平下降越明显[26]。EP-027367可通过加速二聚体核心亚基的组装过程，形成基因组缺陷的衣壳，从而有效抑制HBV复制。体外试验显示，EP-027367对稳定表达HBV的细胞株具有抗病毒活性，且对NAs耐药的细胞亦有活性，并与NAs或其他衣壳抑制剂具有协同抗病毒作用。有动物实验表明，在嵌合小鼠经过单一EP-027367治疗4周后，HBV DNA水平可减少3 lg，而且有着良好的药物耐受性，然而此制剂仍在临床前研究阶段[33]。另一种新型有效的HBV衣壳调节剂GLP-26，在人和狗的血浆、人肝微粒体中均具有良好的稳定性。研究表明GLP-26对抗杂芳基二氢嘧啶突变体T109l有效。体外试验数据证实GLP-26与恩替卡韦具有协同抗病毒作用，能有效降低小鼠模型中HBV DNA、HBeAg以及HBsAg水平[34]。RO7049389是口服的核心蛋白变构调节剂，对HBV A～D基因型均有较高抵抗作用，且与NAs变异体没有交叉抵抗。研究表明，RO7049389与下文将讲述的Toll样受体7（Toll like receptors，TLR7）激动剂（R07020531）联合使用，可强有力地降低小鼠模型中HBsAg以及HBV DNA水平，并且在部分小鼠中可出现抗-HBs，目前在临床试验I期[35]。



4.新型聚合酶抑制剂



    长期NAs治疗的局限性在于其耐药性，而新型的NAs可以减少耐药性的发生。GS-7340或替诺福韦艾拉酚胺（Tenofovir alafenamide, TAF）可作为替诺福韦继任者。由于可在淋巴组织和肝脏中积累，因此对于治疗HBV感染具有巨大潜力。相比替诺福韦，TAF具有较低的肾毒性或骨密度改变风险，目前此制剂已于2015年在美国获得批准上市[36]。而LB80380是一种新型的鸟苷酸类似物，在细胞内可快速磷酸化，从而抑制HBV复制。然而多中心研究表明，其病毒抑制以及HBeAg血清学转换率与恩替卡韦治疗并没有明显的区别[37]。另外几种包括CMX157、AGX-1009以及MIV-210等制剂现仍处于临床II期试验阶段[16]。尽管这些基于NAs的新型单药疗法对清除HBsAg及cccDNA疗效微乎其微，但联合其他直接抗病毒药物或免疫调节剂可能是未来CHB治疗的主要支柱。



5.HBsAg释放抑制剂



    HBsAg具有抑制免疫系统应答的作用，这可能是慢性持续性HBV感染原因之一，因此HBsAg清除是控制HBV感染的关键环节。理论上，HBsAg释放抑制剂将消除由HBsAg蛋白介导的免疫抑制，并可能产生抗-HBs[38]。REP-2055、REP-2139和REP-2165能够阻断HBsAg释放。Bazinet等[38]在试验中将已经接受26周替诺福韦治疗的40例CHB患者随机分为两组，分别接受替诺福韦+Peg IFN+REP-2139或REP-2165两种中的一种和替诺福韦+ Peg IFN两种抗病毒药物，随访至48周。结果显示前组大多数患者实现HBsAg清除，近半数甚至产生抗-HBs。鉴于上述良好的抗病毒效果，我们需要进一步的大样本数据来支持临床使用。

二、抗HBV免疫调节剂

免疫系统包括先天性免疫和获得性免疫应答，是抗HBV感染的重要屏障。因此，免疫调节疗法在清除HBV感染细胞中起着关键作用。



1.免疫增强剂



    人类先天性免疫系统通过诸如TLRs的模式识别受体识别病原体，进而引发抗炎反应。HBV可通过下调TLRs完成免疫逃避，故TLRs激动剂可能是诱导免疫应答的新疗法[39]。目前多数研究集中在TLR7的刺激诱导。在成功证明口服TLR7激动剂GS 9620可诱导黑猩猩体内HBV DNA的长期抑制，并刺激IFNα的产生后[40-41]，Agarwal等[42]让192例CHB患者分别接受不同剂量（1、2、4 mg）GS-9620以及安慰剂12周，并同时口服替诺福韦48周，在第24周观察疗效。在接受GS9620治疗患者中，只有3例实现HBeAg血清学转换，而HBsAg及HBV DNA水平并没有明显降低，其中少部分患者出现类似于Peg IFNα的流感样症状。另一种新型TLR7激动剂RO7020531是双前驱药物，不仅可激活TLR7，亦对TLR8激活有低效能。其安全性高，具有较好的耐受性。小鼠模型研究表明RO7020531可增加生发中心B细胞以及脾脏中HBsAg特异性B细胞和T细胞。然而和恩替卡韦联合使用，HBV DNA水平下降程度与恩替卡韦单用效果并无明显差异，而HBsAg下降效果类似单用RO7020531，对于HBeAg下降及血清学转换无效果。目前此药物仍在临床试验I期[35]。



2.治疗性疫苗



    通过疫苗接种诱导有效的免疫应答被认为是控制HBV感染的有效策略。Martin等[43]研究了一种新的可编码HBV核心蛋白、多聚糖酶和胞膜蛋白三个区域的治疗性疫苗TG1050，可诱导小鼠脾细胞和肝内功能性T细胞产生细胞因子，进而抑制病毒复制。GS-474是一种用以表达乙型肝炎特异性抗原的重组热灭活酵母疫苗，其安全性及耐受性较好。临床前小鼠研究表明，GS-474可以刺激迟发性HBV特异性CD8+T淋巴细胞诱导免疫应答[44]。抗原抗体（HBsAg-HBIG）免疫复合物与明矾结合是另一种疫苗（YIC）。临床研究中，450例CHB患者分别给予YIC或明矾（安慰剂）24周，两组之间的HBV DNA抑制率、HBeAg血清学转换率或肝功能正常化的差异无统计学意义，这可能与宿主的免疫耗竭有关[16]。虽然治疗性疫苗长期以来是CHB一种有前景的治疗方法，但这种策略仍面临挑战。由于病毒抑制与强有力的NAs可能会减少T淋巴细胞衰竭，从而增加治疗性疫苗的有效性，故疫苗联合其他上述制剂可能是未来新的CHB疗法。



3.T细胞抑制受体



    增强抗病毒T细胞应答的另一个潜在策略是抑制程序性死亡受体1(Programmed cell death protein 1, PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4)介导的共抑制信号。阻断PD-1或其受体（PD-L1）后可改善CHB患者病毒特异性T淋巴细胞的功能。用抗PD-L1抗体、恩替卡韦联合治疗性疫苗治疗慢性感染土拨鼠，可长时间控制病毒感染。虽然抗PD-1抗体（BMS-93655）和抗PD-L1抗体（BMS-93655）在晚期癌症患者中表现出显著抗肿瘤反应，但治疗同时可能会引起较多的不良反应。同样，阻断CTLA-4也可能伴随严重的不良反应。因此尽管上述方案有可行的生物学原理，但由于其安全性相对较差，故PD-1抑制剂或其他抑制性T细胞受体制剂的研发相对缺乏[16,45]。



4.其他细胞因子基础上的治疗



    HBV固有免疫应答可能在CHB的消除中起一定作用。细胞因子，如白细胞介素7（IL-7）、IL-12、IL-18和IL-1参与B细胞和T细胞的发育和维持。这些细胞因子能刺激自然杀伤T淋巴细胞恢复受损的HBV特异性CD8+T淋巴细胞功能，从而促进HBV复制的抑制。这些分子在实验室试验中显示出了良好的前景，并在I期试验中进行了评估[16]。

三、结论

近年来，随着HBV治疗的重大进展，HBV已成为一种可以控制的慢性疾病，然而“治愈”仍然难以实现。HBsAg的持续性减低甚至消失是CHB治疗的理想目标。但由于目前治疗CHB的方案HBsAg清除率较低，故越来越多的新型制剂出现，包括针对HBV生命周期的直接抗病毒药物，但大部分的药物处于临床前阶段研究。虽然免疫疗法具有很大的希望，但在慢性HBV感染中免疫平衡、免疫激活和炎症之间的平衡仍有待解决，以避免由于没有病毒消除而延长的免疫激活，从而导致不适当的肝细胞损伤和失代偿。故直接抗病毒制剂联合免疫调节剂来增强患者特异性适应性免疫应答，同时靶向病毒cccDNA和抑制肝脏炎症，将提供更大的机会来实现和维持功能性治愈CHB。

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