评估慢性乙肝抗病毒治疗应答的新型标志物研究进展

Hepbest

编者按：2018年6月9日-10日，第七届亚洲肝炎和艾滋病学术会议（7th Asian Conference on Hepatitis and AIDS，ACHA）在北京举行。此次参会人员90%以上为一线医疗工作者，会议规模历届最大，影响面最广，来自全球9个国家、国内30多个省市的600余名代表参会。上海交通大学医学院附属瑞金医院张欣欣教授在会上梳理了当前评估乙肝抗病毒治疗的新型标志物，主要内容整理如下。

慢性乙肝（CHB）抗病毒治疗的目标是最大限度的长期抑制HBV复制，减轻肝细胞炎症及肝纤维化，延缓和减少肝衰竭、肝硬化失代偿、HCC及其他并发症的发生。目前可能用于抗HBV疗效评价的生物学标志物根据分布位置的不同主要有以下几类：①位于细胞核的标志物，包括rcDNA、cccDNA；②细胞质内的标志物，pgRNA、亚基因组RNAs；③细胞外及血清中的标志物，包括Dane颗粒、HBsAg、cirHBV-RNAs、HBcrAg。HBsAg、HBeAg、HBV DNA等是临床上应用时间较长的经典生物学标志物，而近年来发现的新型标志物如HBV RNA、HBcrAg、抗-HBc定量及cccDNA等的临床价值也逐步得到关注。

一、HBV RNA

HBV RNA是病毒核衣壳在其包裹的由cccDNA转录形成的3.5 kb前基因组RNA（pre-genomic RNA，pgRNA）未逆转录成HBV DNA时便直接获得包膜后由肝细胞释放出来的，其也是HBV DNA负链的逆转录模板。血清HBV RNA用于评估抗HBV治疗效果的可能价值主要包括以下几方面：①独立预测病毒学应答；②在核苷（酸）类似物（NA）治疗停药后预测HBV再活动；③反映NA的治疗效果；④作为NA治疗期间病毒突变的早期指标。相关的研究如Jansen等研究显示，HBV RNA与PegIFN及NA治疗应答相关，接受NA长期治疗的CHB患者的HBV RNA下降水平小于HBV DNA下降水平，基于PegIFN的治疗诱导的HBV RNA载量下降较NA单药治疗更为显著，PegIFN治疗期间HBV RNA降低更为显著且更早（图1、2）。

图1. HBeAg阳性患者治疗期间HBV RNA载量变化情况


图2. HBeAg阴性患者治疗期间HBV RNA载量变化情况

van B?mmel F等研究也显示，血清HBV RNA载量也是NA或PegIFNα-2a治疗的CHB患者HBeAg血清学转换的早期预测指标，出现HBeAg血清学转换的患者HBV RNA下降更为显著，且HBeAg阴性HBV感染的患者HBV RNA水平下降更快。

Wang等的研究也发现，针对NA治疗停药患者，HBV DNA回升水平与HBV DNA pgRNA水平存在相关性，HBV RNA阳性的患者（n=21）均发生病毒再活动，HBV RNA阴性患者仅有3名（25%）发生病毒再活动（图3）。

图3.  NAs治疗停药后病毒再活动时HBV RNA情况

二、HBcrAg

HBcrAg是由HBV PreC/C区编码的HBcAg、HBeAg以及22 kDa前核心蛋白（p22cr）三种蛋白质组成，血清HBcrAg反映肝细胞内cccDNA含量及转录活性。目前主要使用全自动的化学发光酶联免疫方法（Lumipulse System, Fujirebio, Inc.）来检测HBcrAg。

HBcrAg作为一项新颖的生物学指标可能很快成为评估CHB治疗应答和预后的有价值指标。研究提示，在PegIFN治疗期间检测HBcrAg水平有助于确定应答可能性很低的患者，结果中基线肝内cccDNA水平与HBcrAg水平呈显著正相关（r=0.564，P=0.001），基线HBcrAg为8.0 log U/mL时预测12周无应答的比例为94.4%，预测24周无应答的比例为100%。此外也有研究发现，基线HBsAg及HBcrAg用于预测PegIFN治疗的HBeAg阴性CHB患者应答/HBsAg清除的效能较高，特别是用于预测治疗应答时，HBsAg联合HBcrAg的阳性预测值可达0.800，阴性预测值为0.765，而且HBcrAg阳性患者表现出更高的cccDNA水平及转录活性。

三、抗-HBc抗体定量

近年来的研究发现，基线抗-HBc抗体定量水平可用于PegIFN及NA治疗HBeAg阳性CHB患者疗效的预测标志物。研究显示，达到应答的患者有着较高的基线抗-HBc抗体水平（＞3000 IU/mL），而且在末次随访时抗-HBc抗体水平高的患者ALT正常化的比例更高。Xu等也发现，基线抗-HBc抗体滴度是HBeAg阳性CHB患者接受恩替卡韦长期治疗的有效预测指标，基线抗-HBc抗体≥4.65 log IU/mL的患者在144周及240周时的HBeAg血清学转换比例分别为28.0%及35.5%（图4）。

图4.  抗-HBc抗体滴度预测恩替卡韦治疗144周及240周应答情况的ROC曲线

四、cccDNA

   需要肝组织活检是导致cccDNA检测受限的最主要原因。即使在长期NA治疗，甚至获得HBsAg清除和血清学转换后cccDNA仍然在患者肝脏中持续存在。cccDNA定量及其转录活性是临床试验中评估新型HBV治疗方法的重要指标。多项研究也显示cccDNA与血清HBV RNA载量存在显著的正相关（图5）。

图5  cccDNA与血清HBV DNA载量的相关性分析

五、NGS

其他具有潜在评估价值的血清学标志物是基于下一代测序技术的准种结构分析（NGS）。HBV感染是以准种的形式存在，准种的特征包括准种复杂度（Sn）及多样性（Hamming距离、dS、dN）。Han等针对拉米夫定治疗的患者的研究纳入了18例应答患者及18例不应答患者，同步使用二代测序及分子克隆分析准种，并与疗效进行了相关性及ROC分析，结果显示，应答与无应答患者的基线NGS有着显著的差异，此外NGS用于预测应答的AUC（0.7961 vs. 0.6833）要优于基于克隆的桑格测序结构分析（clone-based Sanger sequencing，CBS）（图6）。

图6.  NGS用于预测应答的ROC曲线

六、小结

经典的生物学标志物如HBsAg、HBeAg、HBV DNA等用于预测抗HBV治疗应答的价值已得到了大量研究的证实。而新型的标志物如HBV RNA、HBcrAg、抗-HBc抗体定量及cccDNA等的临床预测价值还需要更多的研究证据来加以验证。此外，为了进一步优化CHB治疗策略及患者的临床预后，还要开发更多的潜在无创生物学评估标志物来指导抗HBV治疗。