GHS2018：使用CRISPR / Cas9可强烈抑制HBV和降解cccDNA

Hepbest

2018-06-22 编辑： 来源：一诺医学 作者：略晓薛

乙型肝炎病毒（HBV）持久存在的关键因素是转录所有病毒RNA并支持HBV生命周期的cccDNA无法清除。为了抑制HBV cccDNA 活性研究人员们进行了很多尝试。

最近的研究显示，APOBEC3A和APOBEC3B脱氨酶被确定为可直接靶向HBV cccDNA的细胞内免疫应答关键因子。APOBEC3A / 3B能使 cccDNA核苷酸脱氨基导致cccDNA突变或降解。

然而，在HBV感染细胞中激活APOBEC3A / 3B是一项具有挑战性的任务，因为病毒可能拥有一套避开宿主抗病毒应答的精心策略。

俄罗斯研究人员利用最近描述的基于CRISPR / Cas9的激活系统，其使用与p300乙酰转移酶[2]或VP64转录激活物[3]融合的核酸酶灭活的Cas9蛋白（nuclease‐dead Cas9 protein）靶向APOBEC / AID家族的启动子和增强子并激活它们的转录。

为了测试这种方法，将dCas9-p300 / VP64共转染到具有HBV编码质粒的HepG2细胞中或转染到HepG2-1.1merHBV细胞中。或者，将从HBV质粒释放的HBV cccDNA用于HepG2共转染实验。

四种gRNA中的每一种在转染后第2天便导致靶基因的强烈和短暂激活（高达20倍），并在第二天迅速下降至基线水平。

通过dCas9-p300或dCas9-VP64激活APOBEC / AID转录将HBV转录抑制了80％至高于 90％。

在APOBEC / AID家族成员中，APOBEC3A和AID对HBV转录具有最深远的影响。然而，只有APOBEC3A导致cccDNA下降60％，APOBEC3B的活化导致cccDNA水平适度下降（0.8±0.02，p <0.05）。

AID和APOBEC3G不改变cccDNA水平。通过3D-PCR和NGS测序在所有实验组中检测到cccDNA脱氨基位点。

DNA损伤反应因子的微阵列分析显示参与核苷酸脱氨基的EXO1（75,4倍），XRCC3（42,5倍，MPG（19,95倍），TOPBP1（8， 64倍）和RAD50表达下降（-142,8倍），这是DNA双链断裂修复的因子。

与以前的研究类似，研究人员未观察到APOBEC3A和APOBEC3B活化的毒性。然而，AID的激活导致大量的RNA转录下降和数种促凋亡和抗凋亡因子（包括TP73（32,6倍））的激活。

总之，通过修饰的CRISPR / Cas9系统瞬时激活APOBEC / AID是一种新颖且安全的降解HBV cccDNA的方法。



英文原文

O‐024: A novel CRISPR/Cas9‐based approach to transient activation of intracellular host restriction factors results in strong suppression of hepatitis B virus and degradation of cccDNA




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