面向功能性治愈慢乙肝的一步：抑制乙肝病毒基因表达！

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面向功能性治愈慢乙肝的一步：抑制乙肝病毒基因表达！
原创 2017-12-19 略晓薛 肝脏时间
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尽管目前已有预防性疫苗和可终止疾病进展和降低肝细胞肝癌风险的抗病毒治疗药物可供选择，但慢性乙肝病毒感染仍然是当今世界主要的公共卫生问题之一，跟人类免疫缺陷病毒（HIV）、出血热、结核病等疾病的严峻形式相类似。据2017年最新全球肝病报告结果提示，全球目前仍有2.57亿的慢性乙肝病毒感染者，使其成为最常见的慢性病毒性感染。由于慢性乙肝病毒（HBV）感染后可发展为肝硬化和肝癌，乙肝病毒感染相关死亡率（887000死亡/年）也是最高的。

目前，全球仅有10%的慢性乙肝病毒感染者已被诊断发现，而仅有1%获得适当的治疗。针对慢乙肝的治疗当前可供选择的只有干扰素和核苷（酸）类似物(NUCs) 两大类。乙肝表面抗原(HBsAg) 的消失被认为是当前慢乙肝治疗的一个主要终点。然而，在使用干扰素或核苷（酸）类似物(NUCs) 治疗的患者中仅有一小部分能够实现HBsAg消失和anti-HBs 血清学转换。虽然HBsAg消失是一个有确切意义的临床治疗终点并被认为可能反映着功能性治愈HBV感染，但这并不意味着实现HBsAg消失就可以实现彻底的病毒清除。

事实上，正如大多数已被感染患者，乙肝病毒感染就是一个病毒持续存在的典型，cccDNA不被清除且与病毒相关的序列整合到宿主的DNA中。临床上若要解决该感染则需要实现对持续感染病毒基因组的控制并通过免疫系统控制残余的感染细胞。

乙肝病毒药物开发和乙肝病毒感染治愈的关键挑战是靶向cccDNA池，其位于受感染肝细胞细胞核，是病毒持续存在的形式，同时还得克服适应性免疫效应因子的耗竭。cccDNA是所有病毒mRNAs以及3.5Kb前基因组RNA（pgRNA）转录的模板，并作为位于细胞质内的核衣壳病毒基因组复制的模板。

近期在HBV生物学上的认知和研究HBV分子工具上的发展已经为我们开启了定位新治疗靶点的新可能。几种新的抗病毒药物和免疫调节剂化合物已经到达临床前和/或早期临床研究阶段，这些化合物旨在通过有限的治疗疗程实现对cccDNA的沉默和/或降低cccDNA池的量进而到达功能性治愈。

如今，研究团体已就几种治愈的定义达成了共识，这些治愈是属于病毒消耗程度是可实现的范畴。这些治愈的定义包括：1）无病毒性治愈（Sterilizing cure）：血清中无法检测到HBsAg，根除HBV DNA，包括肝内 cccDNA 和整合 HBV DNA，甚至可能回归到肝脏从未感染过病毒之前的状态；2）完全治愈（Complete cure ）：血清HBsAg检测不到，清除肝内cccDNA，病毒再激活的风险消失。3）功能性治愈（functional cure）：在完成有限治疗过程后，血清中 HBsAg 和 HBV DNA 水平持续处于未能检测水平，伴随或不伴随乙型肝炎表面抗体（抗HBs）的血清转换，解决残留肝损伤，肝细胞肝癌风险降低（还有几个功能性治愈的指标可供探讨，包括cccDNA转录完全停止，消除cccDNA，完全解决肝损伤，消除HCC风险），这种情况下cccDNA或将持续处于低水平但处于转录失活状态；4）部分性治愈（partial cure）:在完成有限治疗过程后，HBsAg处于可检测水平，但 HBV DNA 持续处于未能检测水平。

正在进行研究的直接靶向病毒生命周期和/或增强抗病毒免疫作用的新型策略中，一个有希望的途径就是降低病毒抗原表达，尤其是将HBsAg降至很低或未能检测水平。为了降低HBsAg水平，可以有以下几种途径：1）消除cccDNA；2）将cccDNA的转录活性进行沉默；3）靶向病毒副本；4）干扰包膜蛋白的翻译、稳定性或释放（如图）。靶向已建立的cccDNA池的新途径包括刺激已感染肝细胞的先天性免疫路径或能导致cccDNA的降低，或通过基因编辑技术建立破坏cccDNA的分子。沉默cccDNA可以通过IFN a以及其他因子的使用来实现，但病毒特异性机制就会发展出降低这类因子表达的办法。总而言之，这些方法仍然需要进行彻底的临床前评估，以解决关于递送，脱靶效应和对感染细胞的特异性的障碍。

对于靶向HBsAg该病毒蛋白本身，现已有使用治疗性单克隆抗体进行中和或滴定来自血流中的HBsAg，或使用核酸聚合物（NAPs）抑制感染肝细胞的HBsAg 分泌。 这两种方法目前都在临床前和临床评估中。

利用我们的小干扰RNA（siRNA）技术的反义寡核苷酸来专注于病毒基因表达的转录后沉默如今也出现了许多让人感兴趣的苗头。他们抑制病毒基因表达和复制的能力已经在体外环境和动物模型中进行拓展性评估，而他们的临床相关性也正在进行临床试验。将HBV特异性siRNA递送至感染的肝细胞的不同方法目前也在进行中的临床研究中使用到。近期的一项研究显示，HBsAg的表达不仅来自游离体cccDNA微染色体，还来自整合进宿主基因组的HBV DNA副本，由于目标序列受到整合的影响，这对SiRNA效应具有影响。这些结果对于新型siRNA的设计和新疗法的终点预期将是非常重要的。

在同期的Journal of Hepatology 杂志中，来自罗氏公司的研究人员报道了他们发现了一种新型的口服生物利用度较好的能抑制HBV 基因表达的小分子(RG7834)。该研究在感染HBV的HepaRG细胞、原代人肝细胞和HBV感染的尿激酶型纤溶酶原激活剂/重度联合免疫缺陷人源化小鼠模型中，评估了RG7834单用或与恩替卡韦联合应用的抗病毒特性和抗HBV选择性。结果显示，跟降低病毒血症但不能降低HBV抗原表达减少的NUC疗法不同，RG7834能显著降低病毒蛋白（包括HBsAg）的水平，以及降低病毒血症。时程RNA-seq分析揭示，作为RG7834处理的应答，HBV mRNA呈现选择性降低。此外，用RG7834口服治疗HBV感染的人源化小鼠导致HBsAg的显著减少，而恩替卡韦对HBsAg水平没有显著影响。

RG7834、恩替卡韦和PegIFNα的联合应用可显著降低人源化肝脏中HBV DNA和HBsAg水平。这是一种非常有趣的HBV抑制剂观察研究，其具有新颖的作用模式。 基于研究结果，提示该化合物不干扰转录因子的基因表达。 RNAseq和Northern印迹分析研究的结果表明RG7834可以直接或间接修饰病毒RNA并促进其降解。该研究中表现出来的亚基因组与前基因组降解的偏好是很有趣的，值得进行更多的实验来阐明RG7834的确切作用机制。观察这些化合物是如何干扰感染细胞内的病毒RNA加工将是非常有趣的。 另一个值得关注的问题是，还可以看看这个化合物是否可以靶向从cccDNA和整合病毒基因组表达的亚基因组转录本，克服与上文讨论的SiRNA有关的问题之一。 考虑到其口服给药和高选择性，即其对映异构体被证明是无活性的，其临床应用的潜力看起来还是很有希望的。

另一方面，与推定的作用模式一致，在免疫缺陷小鼠中观察到，当以单一疗法或联合疗法施用时，该化合物不影响肝内cccDNA池，治疗终止与病毒反弹具有相关性。 这种化合物和目前为HBV开发的大多数直接作用的抗病毒药物的主要问题是，除非它们与抗HBV免疫力的重建具有相关性，否则它们仍将主要是抑制性的。

几项临床研究表明，在HBsAg高水平的患者肝内天然免疫通路的表达和诱导外周血单个核细胞中干扰素刺激基因（ISG）表达的能力更为明显。 尽管就抗原减少对T细胞恢复的影响而言的情况似乎还不太清楚，但将病毒基因表达抑制剂与恢复先天性和/或适应性免疫的策略的联合应用有朝一日成为旨在治愈HBV感染的成功疗法的基石的假设还是很诱人的。 由于一些旨在降低HBsAg水平的直接作用抗病毒药物和免疫调节剂正在进入临床评估阶段，所以伴随病毒学和免疫学研究的联合治疗试验将有助于解决这个问题。


注：该文为法国INSERM U1052 - 里昂癌症研究中心（CRCL）、里昂大学里昂市立医院肝病科 Zoulim 教授发表在Journal of Hepatology杂志上的综述。顺便跟大伙说一下，实在抱歉，略晓薛这段时间仍然在休假中，而且实在太忙，每个地点只能待一天，到处赶时间（所以文中有不少不足之处敬请谅解）！下次发信息应该会在元旦左右。祝各位生活愉快！

buhaobuhuai

非常感谢

windu

几种治愈的定义好像在哪里看过，罗氏太慢了，它成为救世主之前，白衣骑士已经出现了

hp121

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