HBV RNA研究进展

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HBV RNA研究进展
2017-08-10 北京亚太肝病诊疗技术联盟

      目前,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染仍是影响人类身体健康、加重人们生活负担的严重的全球性问题。相关数据显示,全球曾感染过HBV的20亿人口中有2.4亿转化为慢性HBV感染者,虽然抗HBV感染的有效疫苗已经应用了近30年,每年死于HBV感染导致的肝功能衰竭、肝硬化及肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)等相关疾病者仍约有65万人。全球肝硬化和肝癌 患者中,由HBV感染引起的比例约为30%和45%, 虽然我国已由HBV感染高流行区过渡到中流行区(HBsAg阳性率 < 8%),新发HBV感染者减少,但由HBV感染引起的肝硬化和肝癌所占比例更高, 约为60%和80%。
       持续病毒复制是HBV感染者发展到肝硬化和肝癌的重要原因。从生物结构上分析,HBV是一种长度约为3200个碱基、有包膜、部分环状的双链嗜肝DNA病毒。完整的HBV病毒直径为42 nm,又被称为Dane颗粒,由HBsAg组成的包膜和核心抗原组成的核衣壳构成,核衣壳内包裹着HBV基因组和聚合酶。在HBV生存周期中,以cccDNA为模版逆转录生成RNA是HBV复制的开始,也是HBV持续感染的关键因素。HBV的持续复制依赖于可逆转录生成RNA的cccDNA,因而cccDNA是最直接反映体内HBV感染与复制情况的证据,清除了cccDNA就意味着乙型肝炎达到治愈。但目前对cccDNA的分析仍依靠肝组织活检,过程复杂且对患者有一定创伤,因此需要寻找非侵入性并适合临床的标志物以 反映病毒感染及复制情况。自1996年Kock等在慢性HBV感染者血清中检测到RNA,越来越多的研究人员开始关注血清中RNA及其与HBV复制的关系。 本文就近年来有关血清中HBV RNA的研究介绍如下。

1 HBV 在体内的复制过程
HBV侵入人体正常肝脏细胞后,首先在细胞质中脱去核衣壳,形成松弛环状双链DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)。rcDNA进入肝细胞核中通过折叠、扭曲等步骤形成超螺旋结构的cccDNA, 然后cccDNA以自身为模板转录出4种长度的mRNA(3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb),其中3.5 kb的mRNA有2种,分别为前核心区(pre-C)mRNA和pgRNA,二者仅在5’-起始位点有差异,但作用相差甚远,pre-C mRNA可合成乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的前体-前核心区蛋白,而pgRNA则作为逆转录模板,在逆转录酶的作用下合成全长基因组负链DNA,再通过病毒DNA聚合酶的作用合成正链 DNA,与负链DNA一起组成新的rcDNA。新形成的rcDNA一部分进入细胞核再次形成cccDNA重复上一过程,另一部分装配成完整HBV释放至细胞外感染新的细胞。

2 HBV 感染者血清中 HBV RNA 的性质、来源及存在形式
Wang等提出慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者血清中仅存在一种RNA,即长度为3.5 kb的pgRNA,其来源可能为HBV在复制过程中形成的pgRNA衣壳化后并未进行逆转录,而是获得包膜后直接释放出来。因释放出来的病毒颗粒所含的核酸为pgRNA,所以又称为HBV RNA病毒样颗粒。
2.1 HBV RNA的性质 Wang等应用实时荧光定量 PCR(real-time polymerase chain reaction,qPCR)及反转录PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法在11例核苷(酸)类似物(nucleotide analogues,NAs)初治的CHB患者血清中检测到HBV RNA,随后对血清样本进行处理并排除相关干扰后发现,3.5 kb HBV RNA几乎为全部HBV RNA。提示在血清HBV RNA中3.5kb HBV RNA占主要类型。随后研究人员应用RNA印迹技术(northern blot)证实3.5 kb RNA是患者血清中唯一存在的HBV RNA形式。因为3.5 kb RNA存在pre-C mRNA和pgRNA两种形式,研究者通过特殊引物扩增及多重PCR对经恩替卡韦(entecavir,ETV)处理和未经ETV处理的HepAD38和HepG 2.2.15细胞上清液进行检测,测定结果证实3.5 kb RNA为pgRNA而非pre-C mRNA。
2.2 HBV RNA的来源 正常情况下,肝细胞中的pgRNA在逆转录过程中会降解。研究人员预测随着逆转录被抑制,血清中HBV RNA水平将升高。已知ETV可以抑制逆转录的启动,比较经ETV处理和未经处理的HepAD38细胞上清液中HBV RNA水平后发现,前者HBV RNA水平几乎为后者的10倍[(5.91 ± 0.06)log10拷贝/ml vs(7.00 ± 0.03)log10拷贝/ml], 且Huang等[12]通过比较NAs类药物治疗前后CHB患者血清中HBV RNA水平的变化也得到了相同结果。 随后,Wang等分别用可去除蛋白质结构的蛋白酶K和可抑制pgRNA衣壳化的GLS4处理HepAD38细胞上清液,发现蛋白酶K处理后上清液中可检测到HBV pgRNA,而GLS4处理后上清液中HBV pgRNA水平显著下降,从而得出结论:血清中HBV pgRNA是由被感染的肝细胞中的cccDNA转录而成的pgRNA衣壳化后释放入血。
2.3 HBV RNA的存在形式 研究人员先后用PEG沉淀、蔗糖梯度离心方法处理未经ETV处理及经ETV处理的HepAD38细胞上清液,观察不同梯度分数下HBsAg、HBcAg和HBV DNA水平。结果发 现,两种上清液中HBV DNA均在26这一分数段达到高峰,HBcAg也在同一分数段达到高峰,提示HBV病毒颗粒在这一分数段富集。而HBV RNA与HBV DNA及HBcAg有相同的分数分布,提示在 HepAD38细胞上清液或CHB患者血清中检测到的 HBV RNA整合成HBV样病毒颗粒,这与Rokuhara 等通过蔗糖梯度离心并检测发现HBV DNA、HBV RNA和HBcAg在同一分数段形成单峰从而提 出的“HBV RNA整合成类似于HBV DNA的病毒颗粒”的观点相同。而后在ETV处理的Hep AD38细胞实验中观察到HBV DNA大幅下降,HBcAg无明显改变,但两者下降幅度并不一致,而HBV RNA上 升水平以及ETV处理的细胞上清液中HBV RNA水平[(7.00 ± 0.03)log10拷贝/ml]几乎等于未经处理的细胞上清液中HBV DNA水平[(7.01 ± 0.04)log10 拷贝/ml],以上现象为证实“HBV RNA以病毒样颗粒形式存在”这一观点提供了更有力的证据。

3 HBV RNA 的临床研究进展
Rokuhara等认为无论是拉米夫定(lamivudine,LAM)单药治疗还是联合干扰素治疗,在治疗终点时作为病毒学持续应答的预测标志,测量肝内cccDNA水平的价值在许多方面均优于测量血清中HBV DNA水平。NAs并不能抑制cccDNA转录生成mRNA并进一步翻译形成病毒蛋白这一过程,因而核心相关抗原(HBVcrAg)或许与cccDNA水平相关,pgRNA亦是如此。研究人员选取24例连续接受LAM治疗近1年的CHB患者作为研究对象,通过测定其血清中HBV RNA及HBVcrAg水平发现,在LAM治疗过程中,血清中HBV DNA、HBV RNA及HBVcrAg水平均显著下降。而HBV RNA 与HBVcrAg水平在治疗之初及治疗2个月后均显著相关(r = 0.841,P < 0.001;r = 0.777,P =0.001),HBVcrAg与HBV RNA的比值[n = 21; 1.32(1.21~1.52)]在治疗之初与治疗2个月后[n = 17;1.36(1.15-1.54) > 0.2]无显著差异,且 HBVcrAg与HBsAg在LAM治疗期间以同样形式下降,根据“HBVcrAg可能反映肝细胞内cccDNA水平”这一观点预测血清中HBV RNA或许可以反映肝细胞内cccDNA水平,并可作为检测LAM治疗的新标记物。
NAs自1998年应用于临床后,一直面临一个重要问题,即“用药容易停药难”。CHB患者一旦停药,极易引起HBV再激活。但长期用药则会出现耐药性和病毒变异问题,长期应用LAM后出现的酪 氨酸-甲硫氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(tyrosine- methionine-aspartate-aspartate,YMDD)变异就是一个典型的例子。Hatakeyama等在寻找YMDD变异发生预测标志物的过程中发现,不同患者体内HBV DNA的抑制程度存在差异,这种差异或许和体内HBV RNA水平有关。研究还发现,与1年后出现或不出现YMDD变异的患者相比,在1年内出现YMDD变异的患者血清中HBV RNA水平更高,因此,他们提出“检测外周血HBV RNA水平有利于了解YMDD变异的发生”这一观点。研究人员应用实时荧光定量PCR法检测了36例长期应用LAM治疗的CHB患者外周血中HBV RNA水平,发现早期出现变异(12个月内)的患者在LAM治疗3个月时血清HBV RNA水平显著高于晚期(12个月后)出现变异或未出现变异的患者。因此提出假设:CHB患者血清中HBV RNA水平或许对变异的发生有预测作用。但由于样本量较小,且HBV RNA的测量方式不够敏感(检测下限为3.7log10拷贝/ml),结果无统计学意义。故此观点仍有待进一步研究证实。
Tsuge等欲通过研究CHB患者外周血中HBV RNA水平和HBV复制活性的相关性来判断HBV RNA与NAs安全停用的关系。他们选择了36例接受NAs类药物治疗[31例为LAM 100 mg/d、3例为ETV 0.5 mg/d、2例为ADV 10 mg/d或LAM(100 mg/d) + ADV(10 mg/d)]超过6个月的CHB患者,这些患者在主治医师依据个人病情制定的相似但不相同的方案指导下逐步停药。研究者采用实时荧光定量PCR法检测患者外周血HBV DNA及HBV DNA + HBV RNA水平,发现HBV DNA反弹呈时间依赖性,在 停药24周及48周后,HBV DNA反弹率分别为58.3% 和91.7%。而治疗3个月时HBV DNA + HBV RNA水平与停药后24周内HBV DNA反弹率显著相关(P =0.043,OR = 9.474,95%CI:1.069~83.957)。因此提出观点:检测血清中HBV DNA + HBV RNA水平或许可作为预测接受NAs类药物治疗者是否可安全停药的有效指标。王杰等也得出相似观点,即 NAs治疗停止时患者血清HBV RNA水平或许与病毒反弹风险相关。他们选择了33例治疗终止时HBV DNA水平低于检测下限的患者,其中21例患者血清学HBV RNA(+),其余12例血清学HBV RNA 低于检测下限。治疗停止后24周,21例HBV RNA (+)患者均发生病毒学反弹,然而在HBV RNA低于检测下限的12例CHB患者中,仅3例发生病毒学反弹。
Huang等就血清中HBV RNA水平与接受治疗的NAs类药物种类以及患者发生初次病毒学应答的关系进行了研究。他们选取了52例接受ETV或LAM治疗的CHB患者,分别定期测量血清中HBV DNA和HBV RNA水平,直到HBV DNA初次低于检测下限(初次病毒学应答,检测下线2.2log10拷贝/ml)。与接受LAM治疗的患者相比,接受ETV治疗的患者在治疗12周和24周时血清中HBV RNA所占比例(50% vs 84.6%,P = 0.008;38.5% vs 79.6%,P = 0.005)及定量[(3.8 ± 4.1)log10拷贝/ml vs(6.5 ± 3.1)log10拷贝/ml,P = 0.011;(2.9 ± 3.9)log10拷贝/ml vs(6.2 ± 3.8)log10拷贝/ml,P = 0.003)]均更高, 结合NAs药物抑制pgRNA逆转录形成病毒负链DNA的作用机制可知,ETV抑制血清HBV DNA复制的作用强于LAM。除此之外,研究还观察到血清HBV DNA从可检测到低于检测值下限间隔16周内的患者在接受治疗12周时血清中HBV RNA水平远低于间隔大于16周的患者[(3.8 ± 3.8)log10拷贝/ml vs (6.6 ± 3.5)log10拷贝/ml,P = 0.013)]。综上,他们认为血清中HBV RNA水平或许能反映NAs类药物的疗效,并可作为应用ETV和LAM治疗者发生初次病毒学应答的独立预测标志。
Florian等探究了在聚合酶抑制剂治疗过程中患者血清HBV RNA水平对HBeAg血清学转换的预测作用。他们选择了50例HBeAg(+)和12例HBeAg(-)共计62例接受LAM(100 mg/d)或替诺福韦酯(TDF,300 mg/d)单药治疗的患者,分别定期检测其血清中HBV DNA、全长多聚腺苷酸RNA(flRNA)及顿挫型RNA(trRNA)水平后发现,在HBeAg(+)患者中,TDF或LAM治疗3个月及6个月后,患者血清中HBV RNA水平下降与HBeAg血清学转换有强相关性(HBV flRNA和HBV trRNA预测HBeAg血清转换3个月时敏感度分别为96%和92%,特异度分别为67%和82%;6个月时敏感度分别为96%和74%,特异度分别为74%和87%)。在HBeAg(-)患者中,RNA水平动力学过程与随后发生血清学转换的HBeAg(+)患者血清RNA动力学过程一致,即水平显著下降。因早期血清HBV RNA水平下降与随后HBeAg血清学转换具有强相关性,因此认为在HBeAg(+)患者中,动力学改变可作为预测聚合酶抑制剂治疗的应答新工具。
Giersch等研究了NAs类药物和聚乙二醇化干扰素α(polyethylene glycol interferon alpha,PegIFN-α)对血清中HBV pgRNA影响的差异。他们分别用NAs类药物(ETV、LAM)和PegIFN-α处理感染HBV的USB(uPA/SCID/beige)人化小鼠,测量其血清中HBV pgRNA和肝细胞中pgRNA、cccDNA水平,发现NAs类药物处理后血清中HBV DNA下降了2.9 log 拷贝/ml(P = 0.0159),pgRNA 10则轻度上升(0.4 log10拷贝/ml = 0.4206);而 PegIFN-α处理后血清中HBV DNA和HBV RNA均显著下降(1.4 log10拷贝/ml,P = 0.0286;1.0 log10 拷贝/ml,P = 0.0286)。随后,其进一步研究了血清中HBV pgRNA水平与肝细胞中pgRNA和 cccDNA水平的相关性。对处在不同感染阶段的人化小鼠,两种药物处理后其血清中pgRNA水平与肝细胞中pgRNA水平存在显著相关性(PegIFN-α 组血清中pgRNA水平与肝细胞中cccDNA水平无相关性,NAs组则未说明),而未经任何处理的pgRNA水平与肝细胞中pgRNA和cccDNA均存在显著相关性,这提示HBV感染时血清中RNA或许可 以反映肝细胞中cccDNA的活性。王杰等也得出了类似结论,他们分别检测了接受NAs类药物治疗2年以上的41例CHB患者血清中HBV pgRNA及肝细胞中cccDNA水平,发现血清中HBV RNA或许 可以反映肝细胞中cccDNA存在与否及转录活性等状态。但由于检测灵敏度等原因,上述结论仍有待进一步证实。

4 总结与展望
本文就目前HBV RNA研究进展进行了相关介绍,并指出了一些不足之处,可从以下几个方面进行进一步研究:1、之前报道称包含HBV RNA的病毒颗粒不可被包裹并分泌,而近期研究却提出了不同观点,即HBV RNA可被包裹,但仍有待进一步证实;2、虽然已有研究表明,血清中pgRNA或许可以反映肝细胞中cccDNA水平及活性,但由于实验条件所限等原因,仍需进一步研究证实;3、已 报道的临床试验样本量均较小,可通过提高样本数量分析HBV RNA水平与乙型肝炎患者病情严重、进展程度及耐药性的关系;4、结合临床,通过测定治疗过程中HBV RNA水平及变化指导临床用药时间,并根据HBV RNA形成机制促进新药的研发,以建立最优的抗HBV策略。

antiHBVren

之前有研究HBV RNA能够准确判断肝脏的情况，以及预测停药后的反弹情况；
看来，还是有很多待研究的地方，看来临床还有距离

windu

HBV病毒还剩下多少未知的秘密等待澄清呢