认识慢性乙肝持续感染的元凶：cccDNA

tonychant

慢性乙型病毒性肝炎影响着全球超过 2.5 亿人口，每年约有 65 万人死于 HBV 相关终末期肝病。共价闭合环状（ccc）DNA 是慢性乙肝持续感染的元凶，作为病毒复制的中介，其在宿主肝细胞核内以微染色体的形式存在，目前的治疗手段难以将其彻底清除，从而达到慢性乙肝的彻底治愈。
近期的 Gut 杂志上发表了德国弗莱堡大学医院 Nassal 教授的一篇综述，该文概述了 cccDNA 的研究历史、目前研究中存在的困难、近期的研究进展以及与之相关的治疗策略。
HBV 的感染与复制
人 HBV 是嗜肝 DNA 病毒的原型，同属哺乳动物的正嗜肝 DNA 病毒还有旱獭肝炎病毒（WHV）、地松鼠肝炎病毒（GSHV）、毛猴乙型肝炎病毒（WMHBV）等，此外还有水禽类嗜肝 DNA 病毒，如鸭乙型肝炎病毒（DHBV）、鹭乙型肝炎病毒（HHBV）。
1. HBV 的结构特征
如图 1A 所示，HBV 病毒，或称「Dane 颗粒」，由含有 3 种外膜蛋白（血清学上的 HBsAg）的包膜包裹核衣壳（血清学上的 HBcAg）构成。核衣壳内包含的病毒基因组是一个部分双链的松弛环状 DNA，即 RC-DNA。
HBV 基因组最显著的特征在于其结构紧密，功能齐全（图 1B）。HBV 基因组的开放阅读框（ORF）存在重合，一个 ORF 可转录 2 种 mRNA，编码 2 种蛋白，所有基因表达和复制所必须的调节原件都埋在基因序列中。
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图 1.HBV 的基本分子特征。图 A 为病毒结构；图 B 为基因构成（绿色箭头：启动子；EnHⅠ/EnH‖：转录增强子；DR1，DR2：直接重复序列；红色波浪线：正链 DNA 上的 RNA 引物）。
2. HBV 的感染与复制
如图 2 所示，HBV 感染肝细胞始于病毒颗粒表面 L 蛋白被肝细胞表面钠 - 牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）受体识别并结合，可能以内吞形式进入细胞。在胞浆中释放出核衣壳，核衣壳在核心蛋白核定位信号的作用下，进入胞核，并释放出 RC-DNA，并最终形成 cccDNA。
cccDNA 与核小体结合形成独立于细胞染色体外的微小染色体结构，这一过程有赖于 HBx 和核心蛋白的参与。
cccDNA 是病毒转录的模板，其利用宿主细胞的 RNA 聚合酶进行转录，可产生 3 种亚基因组 RNA，用于合成病毒蛋白，以及 2 种长于基因组的 RNA，用于病毒复制、转译核壳等。有效的 cccDNA 转录受到肝脏特异性转录因子及 HBx 的调控。
在细胞浆中，pgRNA 和病毒 P 蛋白一起被新形成的核壳蛋白包裹，在此以 pgRNA 为模板，逆转录形成负链，随后 pgRNA 降解，正链合成，新的 RC-DNA 形成。含有 RC-DNA 的成熟核心颗粒包裹外膜蛋白，在细胞多泡体的参与下分泌出细胞，此外，新生的成熟核心颗粒还可以再次入核，扩充细胞的 cccDNA 池。
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图 2. 肝细胞中 HBV 的生命周期（GVG：粘多糖；NTCP：钠 - 牛磺胆酸共转运多肽）
研究 cccDNA 的技术壁垒
1.  宿主特异性的限制
由上述 HBV 感染的生命周期可见，cccDNA 是 HBV 在肝内进行复制的模板，是建立有效感染的基础。然而，由于 HBV 的宿主范围极窄，目前仅有少量、复杂的体外感染系统可用于研究 cccDNA。
使用相应宿主的原代肝细胞是解决这一难题的策略之一，但人的肝细胞获得困难，替代动物树鼩饲养要求高，价格昂贵。此外原代肝细胞存在最主要的问题在于伴随着 NTCP 表达的逐渐缺失，其对 HBV 的易感性也很快下降。长期 HBV 易感性可通过向免疫缺陷小鼠移植人或者树鼩的肝细胞实现，但技术非常复杂。
2. NTCP 受体发现带来的希望
NTCP 作为 HBV 受体这一发现为 cccDNA 的研究提供了极大便利，通过表达 NTCP 受体，实验中常用的 HepG2、Hu7 等细胞系均可被 HBV 感染，但要获得高感染率仍需在培养体系中加入相当高剂量的病毒颗粒（细胞数量的 104 倍）来实现。
3.  非感染模型难以形成 cccDNA
研究 HBV 的非感染模型，向细胞转染 HBV 质粒或尾静脉高压注射 HBV 质粒等，cccDNA 形成均很少甚至没有。在这些模型中，质粒替代 cccDNA 成为病毒复制的主要模板。与之类似的还有 HBV 转基因小鼠，其 HBV 基因是整合在小鼠基因组中的。
4.  鸭肝病毒模型对 cccDNA 的研究贡献
不同于 HBV，DHBV 在不同的体系中很容易检测到 cccDNA，而鸭肝细胞也相对容易获得，体内试验较为便利。
鸭肝病毒模型阐明了 cccDNA 在肝炎病毒复制周期和持续感染中的重要作用，主要研究结果包括：cccDNA 的形成有赖于逆转录，而非 DNA 的半保留复制；cccDNA 在细胞核内以 cccDNA 池的形式存在，每个细胞核中往往不止 1 个拷贝；检测单个细胞核内 cccDNA 的技术。
近期有研究利用携带一种包膜缺陷 DHBV 病毒的肝细胞系，如 DStet5，包膜蛋白缺陷导致病毒分泌受阻，因此可诱导单个细胞内 cccDNA 水平大幅增加（如图 3），这种 DHBV 在人的肝癌细胞系内也可达到很高的 cccDNA 水平，从而为 cccDNA 的研究提供了便利。
cccDNA 的检测困境
1. Southern blot 检测敏感性有限
由于 cccDNA 呈超螺旋结构，相比与同等长度的 RC-DNA，其具有更高的电泳迁移率，因此 cccDNA 可通过 Southern blot 与其他形式的肝病毒基因组进行鉴别。
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图 3. Southern blot 检测 cccDNA
慢性感染鸭肝炎模型显示单个细胞内平均含有 10 拷贝左右的 cccDNA，不同细胞间拷贝数变化很大，且随着感染的病程具有时间上的波动。
人慢乙肝单个肝细胞拷贝数似乎更低（平均 0.1-1 拷贝 / 细胞），而 Southern blot 检测下限约为 10 拷贝 / 细胞，因此如此低的 cccDNA 水平使得 Southern blot 难以准确的检测到单个细胞的拷贝数。
2.  其他检测方法难以排除 RC-DNA 的干扰
所有基于 PCR 的检测方法，如引物设计在 RC-DNA 正链缺失段两端的「over-gap」PCR，或以环状 DNA 为模板的滚环扩增，但不能绝对排除 RC-DNA 的干扰。另有非 PCR 的侵入分析技术，利用一条引物与 cccDNA 形成 3 链结构，这一结构可被特异性的核酸内切酶识别。
总之，最大化 cccDNA 的选择性，排除 RC-DNA 干扰是准确定量 cccDNA 的关键，只对胞核而非全细胞进行检测，并联合外源性核酸酶特异性降解 RC-DNA 或为一种解决策略。另外应注意单链上的一个缺口即可造成双链解螺旋，导致低估 cccDNA 载量。
对研究者而言，应当清楚每一种方法的缺陷，并亟需建立一种标准的高敏感性的检测方法。对读者而言，应清楚的认识到，对于已经处于很低水平的 HBV cccDNA，宣称进一步降低其载量的数据支持或并不充分。
cccDNA 的生命周期
1.  宿主 DNA 修复系统参与 cccDNA 的从头合成
侵入肝细胞的 RC-DNA 是 cccDNA 形成的直接前体，由 RC-DNA 形成 cccDNA 称为「从头合成」，这一过程需要去除负链 5』端的末端 P 蛋白和 3』端的末端过剩段（r），两端连接成环，同时正链的 5』端去除 RNA 引物，3』进行延长，两端闭合。
在 cccDNA 从头合成过程中，病毒 P 蛋白有部分参与，但宿主 DNA 修复系统在其中发挥了重要作用，主要参与的酶有核酸内切酶、酪氨酰磷酸二酯酶、DNA 聚合酶、多核苷酸激酶或磷酸酶、DNA 连接酶等（如图 4）。
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图 4. RC-DNA 的结构特征
2. cccDNA 的确切生命周期尚不清楚
核苷类药物停药或免疫抑制状态下病毒反弹提示 cccDNA 可持续存在长达数十年，但目前尚没有人类 cccDNA 消减动力学数据。土拨鼠和鸭肝感染模型提示 cccDNA 的半衰期为 33 和 57 天。黑猩猩急性感染时，cccDNA 半衰期缩短至 3 天，但仍有痕量 cccDNA 可持续数年。
在慢性感染中，新的 cccDNA 的产生与已存在 cccDNA 的消失受到众多因素影响，二者的综合结果决定了 cccDNA 池的大小。当前，我们仍无法确切知道单个 cccDNA 分子的生命周期。
有待解决的 cccDNA 生物学问题
1. cccDNA 的生命周期取决于单个分子，还是存在 cccDNA 的更新？如果存在更新，那么是经过何种途径？（细胞内？细胞间？或细胞外？）其动力学特征如何？
2. 在急性自限性 HBV 感染中，cccDNA 是如何被清除的？
3. 如果细胞可以从 cccDNA 的层面获得免疫学治愈，那其具体机制如何？
4. cccDNA 在细胞分裂过程中是否存活？如何存活？
5. 什么因素限制了 cccDNA 在大多数人的肝癌细胞系及鼠肝细胞的形成和积累？
6. 为什么这种限制在鸭 HBV 并不明显，甚至是感染人的细胞？
7. 何种机制限制了 cccDNA 的无限扩增，这种机制可用于减少 cccDNA 的拷贝数么？
可能的治疗靶点
以 cccDNA 作为治疗靶点，首先需要阐明 cccDNA 的生命周期取决于单个分子的生命期还是通过更新维持 cccDNA 池。若没有 cccDNA 的更新，那么阻断 RC-DNA 向 cccDNA 转变仅在感染之初有效。
1.  阻断 NTCP 受体
在人源化小鼠模型上，低剂量 HBV 感染后予以 NTCP 受体阻断剂 Myrcludex B 治疗，不仅可以阻止病毒播散，还可使已感染细胞 RC-DNA 向 cccDNA 的转变过程受损。这一结果上需要在临床研究中加以确认。
2.  靶向 DNA 修复系统
第二个可能的靶点是宿主 DNA 修复系统。然而，宿主 DNA 修复系统繁杂庞大，且存在代偿机制，阻断其中某条通络或并不能阻断 cccDNA 的形成，而大范围阻断将影响到细胞本身的 DNA 修复。
3.  阻断 RC-DNA 入核
另一个替代策略是阻断 RC-DNA 前体入核，RC-DNA 的核转运依赖于核衣壳，靶向核衣壳的药物正在研发当中。
4.  诱导核衣壳在胞浆分解
诱导组装空的核衣壳或不规则的聚合物，将破坏核衣壳的稳定性，它们或在胞浆中解体，RC-DNA 释入胞浆，不仅无法达到胞核，反被胞浆 DNA 感受器识别，诱导 1 型干扰素的产生。
需要再次强调的是，减少已有的 cccDNA，需要以 cccDNA 池通过更新维持其数量为前提。
5.  功能性失活 cccDNA
cccDNA 的转录受到外部调控，靶向这些细胞调控机制或达到 cccDNA 功能性失活。这类选择包括干扰素α、靶向 HBx 的药物，以及 DNA 损伤结合蛋白 DDB1。
然而功能性失活 cccDNA 的局限在于在 cccDNA 存续期间需要持续干预。此外，转染无转录活性 cccDNA 的细胞对免疫介导的 cccDNA 清除更加稳定。因此这一观点需要更多的研究加以证实。
6.  直接清除已有 cccDNA
肝细胞内 cccDNA 池的稳态取决于 cccDNA 消长的速度。由于 cccDNA 更新动力学尚不明确，清除已有的 cccDNA 似乎是更加直截了当的选择。在慢性感染条件下，清除已有 cccDNA 有两种策略，一是免疫介导的 cccDNA 的清除，二是设计核酸酶对基因进行编辑。
⑴  免疫清除
天然免疫和适应性免疫在清除急性 HBV 感染时发挥重要作用，慢性 HBV 感染存在免疫应答的不足，重新建立有效的免疫应答意义重大。
免疫介导的 cccDNA 清除包括两个层面：一是从肝细胞内清除 cccDNA，即非溶细胞式清除；二是由杀伤性 T 细胞破坏含有 cccDNA 的肝细胞。两种机制在急慢性 HBV 感染时都存在，但各自的相对贡献尚不清楚。
近期一项研究提示非常高剂量的干扰素 -α，或有效激活淋巴毒素 -β受体可直接靶向作用于 cccDNA 的完整性，经 APOBEC3A 和 B 介导负链去氨基作用，并最终降解 cccDNA。
尽管在某些方面存在争议，Toll 样受体 7 激动剂 GS-9620 的临床前试验结果充满希望，肯定了激活天然免疫应答的治疗价值。
⑵  基因编辑
在不同免疫介导的 cccDNA 下降过程中，一部分 cccDNA 似乎相当顽固，难以进一步降低。这或许是含有 cccDNA 细胞本身的特质，也有可能是 cccDNA 存在更难以被分解的形式，例如甲基化、染色体化等。
利用核酸酶进行基因编辑的技术进步催生了靶向 cccDNA 的新工具，例如锌指核酸内切酶、类转录激活效应物核酸内切酶、以及 RNA 引导的成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 基因组编辑技术。
这类新技术仍面临诸多挑战，如不能特异性靶向含有 cccDNA 的肝细胞，线性病毒 DNA 整合到肝细胞基因组，以及 DNA 修复系统可能再次生成完整的 cccDNA 等。此外，细胞内过量的 RC-DNA 是否会影响到药物准确靶向 cccDNA 并不清楚。
因此，发展其他新技术，包括治疗性疫苗、反义寡核苷酸和基于 RNA 干扰等，仍具有广阔的空间。
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图 5. 靶向 cccDNA 的潜在治疗策略
总结
cccDNA 在 HBV 持续感染中的作用毋庸置疑，治愈慢性乙肝将必须攻克这一难题。
目前，受限于体内体外实验模型的局限，对 cccDNA 的形成、降解等生物学特性的认识仍存在许多空白，随着细胞感染系统和小动物模型的建立，这些问题有望在不远的未来得以解答。彻底消除 cccDNA，仅依靠一种策略可能难以实现，联合对 cccDNA 生化特征的认识、机体在急性感染时免疫系统清除 cccDNA 的方式以及操纵编辑 DNA 的新技术，或有望实现这一目标。
希望终有一天，慢乙肝可以像慢丙肝一样被治愈。

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灵魂不屈

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