病毒DNA的CRISPR / Cas9切割 有效地抑制乙肝 病毒

StephenW

CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA
efficiently suppresses hepatitis B
virus
Vyas Ramanan1,*, Amir Shlomai2,*,#, David B.T. Cox1,6,9,*, Robert E. Schwartz1,3,4,
Eleftherios Michailidis2, Ankit Bhatta2, David A. Scott6,11, Feng Zhang1,6,10,11,
Charles M. Rice2 & Sangeeta N. Bhatia1,3,5,6,7,8

Chronic hepatitis B virus (HBV) infection is prevalent, deadly, and seldom cured due to the
persistence of viral episomal DNA (cccDNA) in infected cells. Newly developed genome engineering
tools may offer the ability to directly cleave viral DNA, thereby promoting viral clearance. Here, we
show that the CRISPR/Cas9 system can specifically target and cleave conserved regions in the HBV
genome, resulting in robust suppression of viral gene expression and replication. Upon sustained
expression of Cas9 and appropriately chosen guide RNAs, we demonstrate cleavage of cccDNA by
Cas9 and a dramatic reduction in both cccDNA and other parameters of viral gene expression and
replication. Thus, we show that directly targeting viral episomal DNA is a novel therapeutic approach
to control the virus and possibly cure patients.
Hepatitis B virus (HBV) chronically infects over 250 million people worldwide. Chronically infected
individuals are at an increased risk for deadly complications, including cirrhosis, end-stage liver disease
and hepatocellular carcinoma, resulting in approximately 600,000 deaths per year1. HBV is a member
of the Hepadnaviridae family and its life cycle involves both DNA and RNA intermediates. The HBV
genome exists in the nuclei of infected hepatocytes as a 3.2kb double-stranded episomal DNA species
called covalently closed circular DNA (cccDNA). cccDNA is a key component in the HBV life cycle,
since it is the template for all viral genomic and subgenomic transcripts2. Currently approved HBV therapies
act post-transcriptionally to inhibit viral replication and thus fail to target or eliminate the cccDNA
pool, which exhibits extraordinary stability and persistence3. Consequently, these drugs must often be
taken indefinitely to prevent viral rebound. Agents that act directly on viral DNA to deplete this reservoir
may represent more desirable and possibly curative therapeutic alternatives4.
To this end, targeted nucleases may provide an efficient and specific way to damage the HBV genome
while sparing host genomic DNA5–7. Targeted nucleases catalyze double-stranded DNA break (DSB)
formation, which leads to the formation of mutagenic insertions and deletions (indels) through error-prone
nonhomologous end-joining (NHEJ) at the target DNA locus. Recently, the type II CRISPR-Cas system
of Streptococcus pyogenes SF370 has been adapted as an RNA-guided, sequence-specific DNA nuclease
for use in mammalian cells8,9. CRISPR/Cas9 and other genome engineering technologies have been
employed to design candidate therapeutics via gene targeting, knockout of beneficial host genes, and
mutation of integrated viruses10, and we sought to further study the application of CRISPR/Cas9 to direct
targeting and cleavage of HBV cccDNA. We hypothesized that by directly targeting the HBV genome
for cleavage using CRISPR/Cas9, we could suppress HBV by mutagenizing critical genomic elements or
decreasing the stability of cccDNA and other viral intermediates through repeated linearization of the
circular genomes (Fig. 1a).

1Department of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139,USA.
2Laboratory of Virology and Infectious Disease, Center for the Study of Hepatitis C, The Rockefeller University,New York, NY 10065, USA.
3Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA 02115,USA.
4Division of Gastroenterology and Hepatology, Weill Cornell Medical College, New York, NY 10065, USA.
5Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge,MA 02139, USA.
6Broad Institute, Cambridge, MA 02139, USA. 7Howard Hughes Medical Institute, Cambridge, MA
02139, USA.
8Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge,
MA 02139, USA.
9Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139.
10Department of Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139.
11McGovern Institute for Brain Research, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA 02139
*These authors contributed equally to this work. #Current address: The Liver Institute, Rabin Medical Center, Beilinson
hospital and the Sackler Faculty of Medicie, Tel-Aviv University, Tel-Aviv, Israel Correspondence and requests for
materials should be addressed to F.Z. (email: [email protected]) or C.M.R. (email: [email protected]) or S.N.B. (email: [email protected])

StephenW

病毒DNA的CRISPR / Cas9切割
有效地抑制乙肝
病毒
维亚斯Ramanan1，*，阿米尔Shlomai2，*，＃，大卫·柯氏Cox1,6,9，*，罗伯特E. Schwartz1,3,4，
埃莱夫塞里奥Michailidis2，ANKIT Bhatta2，大卫·Scott6,11，冯Zhang1,6,10,11，
查尔斯·Rice2＆桑吉塔N. Bhatia1,3,5,6,7,8

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是普遍的，致命的，因为很少固化到
持久的病毒游离DNA（cccDNA的）在受感染的细胞。新开发的基因工程
工具可以提供直接裂解病毒DNA，从而促进病毒的清除能力。在这里，我们
表明CRISPR / Cas9系统可以专门针对和切割保守区域的乙肝病毒
基因组，从而导致病毒基因表达和复制的鲁棒抑制。在持续
Cas9表达和选择适当的RNA指导，我们证明了的cccDNA裂解
Cas9并大大降低了两个cccDNA的和病毒基因表达的其他参数和
复制。因此，我们表明，直接针对病毒附加型的DNA是一种新的治疗方法
控制病毒和可能治愈的患者。
乙型肝炎病毒（HBV）感染慢性全球超过2.5亿人。慢性感染
个体的风险增加致命的并发症，包括肝硬化，终末期肝病
和肝细胞癌，导致每YEAR1约600,000人死亡。乙肝病毒是一个成员
的嗜肝家族和其生命周期涉及DNA和RNA中间体。乙肝
基因组存在于感染的肝细胞的细胞核作为3.2kb双链游离DNA种类
所谓的共价闭合环状DNA（cccDNA的）。 cccDNA的是在HBV生命周期中的关键部件，
因为它是对所有的病毒基因组和亚基因组transcripts2的模板。目前批准的治疗乙肝
充当转录后抑制病毒复制，从而不能靶向或消除cccDNA的
游泳池，这表现出非凡的稳定性和persistence3。因此，这些药物常常必须
无限期地采取措施防止病毒反弹。直接作用于病毒DNA剂耗尽此储
可能代表更理想，并可能治愈的治疗alternatives4。
为此目的，有针对性的核酸可提供一种有效的和具体的方式来破坏HBV基因组
同时保留宿主基因组DNA5-7。有针对性的核酸酶催化双链DNA断裂（DSB）
形成，它通过容易出错导致诱变插入和缺失（插入缺失）的形成
非同源末端连接在目标DNA位点（NHEJ）。近日，II型CRISPR-CAS系统
化脓链球菌SF370的已被改编为一种RNA指导的，序列特异性的DNA核酸酶
用于在哺乳动物cells8,9使用。 CRISPR / Cas9和其他基因工程技术已
通过采用基因打靶，有益的宿主基因敲除，并设计候选疗法
突变的综合viruses10的，我们试图进一步研究CRISPR的应用/ Cas9指导
定位和HBV cccDNA的裂解。我们假设，直接针对HBV基因组
使用CRISPR / Cas9乳沟，我们可以通过诱变基因组的关键因素抑制HBV或
通过反复线性递减的cccDNA和其它病毒的中间体的稳定性
圆形的基因组（图1a）。

教研室的卫生科学与技术学院，剑桥，马萨诸塞州02139，美国麻省理工学院。
病毒学2Laboratory传染病，中心为丙型肝炎，洛克菲勒大学，纽约，纽约10065，美国的研究。
3Department医学，布莱根妇女医院，波士顿，MA 0​​2115，USA的。
4Division胃肠病学和肝病，威尔康乃尔医学院，纽约，纽约10065，美国。
5Department电气工程与计算机科学，麻省理工学院，剑桥，MA 0​​2139，USA的。
6Broad学院，剑桥，马萨诸塞州02139，USA。 7Howard休斯医学研究所，马萨诸塞州剑桥
02139，USA。
8Koch研究所综合癌症研究，技术，剑桥的麻省理工学院，
MA 02139，USA。
9Department生物，技术，剑桥，MA 0​​2139，美国麻省理工学院。
10Department脑与认知科学，麻省理工学院，剑桥，MA 0​​2139的。
11McGovern脑研究所，技术，剑桥，MA 0​​2139，美国麻省理工学院
*这些作者贡献同样对这项工作。 #Current地址：肝脏研究所，拉宾医学中心，贝林松
医院和特拉维夫大学赛克勒学院Medicie的，特拉维夫，以色列通信和请求
材料应该给F.Z. （电子邮件：[email protected]）或C.M.R. （电子邮件：[email protected]）或S.N.B. （电子邮件：[email protected]）

StephenW

这不是一个新的药物，而是一种新的概念

StephenW

Discussion
Although largely unexplored in mammalian systems, bacteria and archaea utilize sequence specific DNA
nucleases to interfere with viral replication17. Inspired by CRISPR’s evolutionary origins, we aimed to
exploit the antiviral activity of Cas9 to target HBV DNA in mammalian cells. We show that targeting
multiple conserved regions of HBV with Cas9 results in robust suppression of viral replication and direct
mutagenesis and depletion of cccDNA. While integrated forms of HBV DNA were not depleted by Cas9
cleavage, these forms should not contribute to viral rebound in vivo18, and Cas9-driven mutagenesis
of these sequences nonetheless would damage the viability of viral proteins generated from integrants.
The unique advantages of the CRISPR/Cas9 system (such as multiplexed targeting) are of interest in
developing antiviral applications, and indeed, very recently other groups have published examples of
Cas9 cleavage of HBV in multiple model systems19–22. Our work provides an extension beyond these
complementary studies, by demonstrating the anti-HBV effects of sgRNAs specifically targeting highly
conserved regions of HBV in vitro and in vivo, by directly confirming mutagenesis in cccDNA in a de
novo infection model of HBV, and extending this antiviral activity to patient-derived virus. Additionally,
our finding that appropriately chosen virus-targeting sgRNAs can avoid inducing off-target cleavage,
even upon sustained Cas9/sgRNA expression, strengthens the case for selecting viral targets as good
candidates for CRISPR/Cas9 therapeutic use23.
Interestingly, while Cas9/sg17 was efficient in suppressing infection and in directly cleaving nuclear
cccDNA, Cas9/sg21 efficiently cleaved only integrated but not episomal DNA, which resulted in a lack of
activity for Cas9/sg21 in de novo infection experiments (data not shown). The reason for this is unclear
and warrants further study. Cas9 is a large multi-domain protein, and thus one hypothesis is that particular
regions of the HBV genome are differentially accessible to Cas9 because of the tightly packed
physical architecture of cccDNA. This underscores the importance of using models of authentic cccDNA
to investigate therapeutic applications of targeted nucleases for HBV, and suggests that a careful selection
of targets and guides will be required to achieve a substantial mutagenesis and depletion of viral DNA. In
addition, our proof of concept experiments show that multiplexing sgRNAs can generate stronger antiviral
effects (Fig S2), suggesting that this strategy may further maximize CRISPR-mediated restriction of
components of the viral life cycle, possibly including cccDNA stability.
This study provides a proof of concept, but clinical translation of CRISPR/Cas9 systems to cure HBV
will require some advances over the work described here. First, an exhaustive profiling of possible Cas9
target sites on cccDNA can uncover optimal target sites based on cccDNA accessibility and sgRNA
binding properties. Secondly, delivery of Cas9/sgRNA constructs in vivo will require the use of clinically
relevant delivery vectors such as AAV, which may require additional modifications such as switching to
smaller Cas9 orthologs to save packaging size30. Finally, although we could not find evidence of off-target
cutting in our directed sequencing, possibly due to the low homology between viral and human genomic
Cas9 targets, an extensive genome-wide profiling of off-target effects is warranted.
The unusual persistence of cccDNA is currently the major obstacle for curing chronic HBV infection.
To eliminate the virus and to prevent possible re-activation, it is probably necessary to eliminate all or
at least the vast majority of episomal DNA from hepatocytes through a combination of exogenous treatment
(presented here) and immune-mediated endogenous clearance. CRISPR/Cas9-mediated therapy
may synergize with currently-used RT inhibitors, which should block the formation of new molecules of
cccDNA via re-entry of newly synthesized replicative forms to the nucleus. The developments proposed
above represent an active area of investigation for groups looking for ways to use CRISPR in a therapeutic
fashion more broadly, which may accelerate progress toward an anti-HBV CRISPR therapeutic.
In summary, these results constitute the first example of CRISPR/Cas9 systems directly targeting an
authentic pathogenic virus with episomal DNA, and demonstrate the potential for cccDNA-directed antiviral
therapy using Cas9, which may represent a significant step towards the cure of chronic HBV infection.
The results demonstrated here may also be used to inform the development of CRISPR/Cas9-based
therapeutics for other DNA viruses, such as herpesviruses and papillomaviruses that use an episomal
DNA as a template for their gene expression and replication.

StephenW

讨论
尽管在哺乳动物系统，细菌和古细菌基本上还未利用序列特异性DNA
核酸干扰病毒replication17。由CRISPR的进化起源的启发，我们的目的是
利用Cas9的抗病毒活性的靶在哺乳动物细胞中的HBV DNA。我们表明，靶向
HBV与Cas9导致病毒复制和直接的强大的镇压多个保守区域
诱变和cccDNA的枯竭。而HBV DNA的整合形式不是由Cas9耗尽
乳沟，这些形式不应该助长病毒反弹vivo18和Cas9驱动突变
这些序列中的仍然会损害从整合体产生病毒蛋白质的生存能力。
在CRISPR / Cas9系统（如复用靶向）的独特优势是利率
开发抗病毒应用程序，并确实，最近其他团体纷纷发表例子
HBV的多模型systems19-22 Cas9乳沟。我们的工作提供了超越这些的延伸
互补的研究，通过展示的sgRNAs专门针对高度抗HBV作用
保守的HBV的区域在体外和体内，通过直接确认诱变cccDNA的以脱
乙肝病毒的新的感染模型，并延伸此抗病毒活性对病人衍生的病毒。此外，
我们的发现，即选择适当病毒靶向sgRNAs可避免导致脱靶切割，
即使在持续Cas9 /因组表达，加强了病毒选择作为目标的好案例
候选人CRISPR / Cas9治疗use23。
有趣的是，Cas9 / SG17在抑制感染和直接裂解核是有效的
cccDNA的，Cas9 /高效SG21只能切割整合而不是游离DNA，导致缺乏
（未示出数据），用于Cas9 / SG21中从头感染实验活性。这样做的原因是不清楚
和值得进一步研究。 Cas9是一个大的多结构域蛋白，因而一个假​​设是，特别
HBV基因组的区域是由于紧密填充差分访问Cas9
cccDNA的物理架构。这突出使用正宗的cccDNA车型的重要性
调查的目标核酸乙肝的治疗应用，并建议仔细挑选
的目标和导将被要求达到的病毒DNA的相当诱变和耗竭。在
此外，我们的概念验证实验表明，复sgRNAs可以产生更强的抗病毒
效果（图S2）中，这表明这种策略可以进一步最大化CRISPR介导的限制
病毒生命周期的成分，可能包括cccDNA的稳定性。
这项研究提供了一个概念证明，但CRISPR / Cas9系统的临床转化治愈乙肝
将需要一些进步在这里所描述的工作。可能Cas9首先，详尽剖析
对cccDNA的目标站点可以根据cccDNA的可访问性和因组发现最佳靶点
绑定属性。其次，交付Cas9 /因组的构建在体内会要求使用临床
有关递送载体如AAV，这可能需要额外的修饰，如切换到
小Cas9直系同源节省包装size30。最后，虽然我们找不到脱靶的证据
切割中的定向测序，这可能是由于病毒和人类基因组之间的同源性低
Cas9目标的脱靶效应广泛的全基因组分析是必要的。
cccDNA的不寻常的持续性是目前治疗慢性乙肝病毒感染的主要障碍。
为了消除这种病毒，并防止可能重新激活，它可能是必要的，以消除所有或
至少通过外源性治疗相结合的绝大部分游离DNA的肝细胞
（这里介绍）和免疫介导的内生间隙。 CRISPR / Cas9介导疗法
与目前所使用的RT抑制剂可以协同，这应该阻止新分子的形成
经由再入的新合成的复制形式到细胞核cccDNA的。事态的发展建议
上述代表调查的有效区域团体寻找各种方法来使用CRISPR在治疗
时尚更广泛地说，其可以加速朝向抗HBV CRISPR治疗进展。
总之，这些结果构成直接靶向CRISPR / Cas9系统的第一示例
正宗的致病病毒与游离的DNA，并展示对cccDNA的指导抗病毒的潜力
治疗使用Cas9，这可能代表了对慢性HBV感染治愈一个显著的一步。
这里展示的结果也可用于通知CRISPR的发展/ Cas9基
疗法为其他DNA病毒，如疱疹病毒，并且使用附加型乳头瘤病毒
DNA作为对他们的基因表达和复制的模板。

9病成医

这个治疗方向值得期待。但这项技术目前进展到那个阶段了？如果仅仅是概念阶段，那以后的变数就大了。

42年才知道

CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的 CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。

42年才知道

1原理
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此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。[1]
作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合。因此，Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。[1]
2应用
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基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。[2]
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。[2]
CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。[2]
3技术优缺点
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CRISPR （Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats）是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。 他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。[3]
传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。[3]

tonychant

细胞里面是一回事，人体又是一回事，谨慎乐观

战天斗hbv

可以用技术成熟度表示