药物清除HBV病毒共价闭合环状DNA的研究进展

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慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)的存在是乙型肝炎病毒(HBV)持续感染的关键。作为HBV前基因组RNA复制的原始模板，病毒在宿主细胞内复制中形成第一中间体，对乙肝病毒的循环复制以及感染状态的建立具有重要意义笔者从cccDNA的角度，对HBV感染和清除过程以及cccDNA在CHB中的作用、抗病毒治疗现状以及药物清除cccDNA的相关研究进行综述，旨在帮助临床医师理性确定抗病毒治疗策略，预测病毒学应答以及判断停药时机等方面具有重要指导意义。
1cccDNA的形成及在慢性乙型肝炎中的作用
1.1HBV基因组是部分双链的环状DN:4分子(relaxedcir-cula,reDNA),HBV侵人肝细胞后脱去包膜，HBVDNT-1进人肝细胞核内，在HBV聚合酶的作用卜，以单核昔酸填补HBVDNA正链的缺口形成完整的双链环状D\A，然后在拓扑异构酶作用下形成超螺旋结构的cccDNA.,HBVD\A的复制则以cccDN_1为模板，先复制出前基因组RNA，再以前基因组RNA反转录负链DN:}，又合成正链D\'A，变成双链环状DNA,最后形成子代D1A，子代DN;1保留了母代DNA完整准确的序列.cccNA的形成是HBV侵人细胞后在细胞内进行复制的起始步骤及病毒感染状态建立的最重要的标志。
1.2cccDNA不断折叠形成超螺旋结构DNA分子结构井以相对稳定的数量存在于肝细胞内，感染0发细胞免疫应答导致肝细胞受损，并与血清和肝内的其他免疫活性标志物水平，如ALT、纤维化状态、HBSAg和FIBcAg等，具有一定的相关性u。Laras等s通过对未经治疗的12例HBeAg阳性和22例HBeAg阴性CHB患者肝内ccc.DNA和前基因组RNA检测发现，cccDNA作为HBV持续复制和稳定存在的标志物，和HBV病毒活性以及乙肝病毒感染阶段相关，和前基因组RNA一起一也可以为IIBV的自然史和长期的抗病毒治疗提供更多的信息。赵克开等对57例CHB患者血清cccD-NA检测发现，在诊断重型肝炎患者其特异度高达96.15%，认为血清中检测出HBVcccDN_4表明大量肝细胞坏死，提示cccDNA可能成为重型肝炎肝衰竭的重要诊断指标。Tieland等认为，急性HBV'感染期cccDNA与免疫反应性纤维结合素(IF'N)结合在肝细胞中产生cDs十T细胞，而cDs下T细胞是肝细胞发生病理损害的主要介导者，而ceeDNA的持续存在导致疾病慢性化进程肝硬化患者血清中HBVDNA主要以cccDNA形式存在，HBV持续复制导致肝脏纤维化并n}-穿肝硬化的全过程;HB}%DNA通过整合宿主肝细胞DNA，其HBV的X基因改变肝细胞的基因表达导致肝细胞癌(HCC)的发生。Wong等a运用侵人法((invaderassay)检测25例原发性肝癌患者，发现肿瘤组织与非肿瘤组织的HBVDX:a差异无统计学意义(P=0.903)，但肿瘤组织的。<cDN1明显高于非肿瘤组织(0.35vs0.16拷贝/细胞P=0.030),81%的肿瘤组织HBVDNA均以cccDNA的形式存在。
2药物清除cccDNA的研究现状
2.1目前用于抗HBO~的药物主要有干扰素(Interferons,IFN)和核普(酸)类似物(nucleosideanalogue)核昔(酸)类似物是聚合酶抑制剂，主要通过细胞激酶代谢成三磷酸形式，选择性或竞争性抑制病毒聚合酶的催化作用，类似物的整合可导致新生病毒基因组的链终止。研究发现拉米夫定和阿德福韦均可部分抑制HBV感染后初始的cccDNA的转换，但即使是联合用药，也不能完全抑制感染后初始的cccD-NA转换v-'0Dandri等f;1用3种剂量阿德福韦(1,10和100},mol/作用于感染WHV的土拨鼠肝原代细胞，结果显示R%H}%DN.4合成下降90%，分泌病毒颗粒下降98070，而cccDNA合成、HBe1g分泌和病毒RNA水平却无明显改变。
Cheng等使用阿德福韦醋和恩替卡韦治疗核昔(酸)初治的36例患者(ETV14例，ADV22例)48周，并定量检测肝内HBVDNA和。ccDNA，结果表明，和安慰剂治疗组相比，肝内HBVD>\'A显著降低，但cccDNA下降并无明显区别(一0.17v、-0.01vs-0.02拷贝/细胞)。多因素回归分析表明，尽管阿德福韦酷和恩替卡韦并不足以降低肝内cccDNA的水平，但是口服抗病毒药物可能会改善肝脏的炎症坏死和纤维化程度。Schult:与Chisari-'}用重组鸭干扰素(RecombinantDuckInterferonGamma,DuIFN2y)抑制抗鸭乙肝病毒(DH-B'V，在DHBV感染前后，以100U/ml浓度的DuIFN2，作用培养细胞，可使cccDNA水平降低为对照组的1/10一1/20除了单一使用核昔(酸)类似物或者干扰素尝试降低cccD-NA水平外，Lu等L}4J通过使用拉米夫定或IFNa-2b单药或拉米夫定序贯IFNa-2b治疗71例HBeAg阳性的CHB患者48周，发现在12周获得病毒学应答预示治疗结束后肝内HBVDNA和cccDNA的水平大幅降低。Wurstborn等通过PegIFNa-2b联合阿德福韦酷联合治疗CHB患者48周，发现与治疗前相比联合治疗能显著降低cccDNA的水平(-2.4Log10)，而cccDNA的降低又和HBsAg的降低显著相关。
2.2细胞分裂抑制剂对cccDNA合成的影响尽管有拉米夫定和阿德福韦的存在，在感染DHBV的鸭原代肝细胞培养基和感染HBV的树韵原代肝细胞培养基中，cccDNA依然能够从头合成’617」。Turin等用细胞周期阻断剂丁酸钠作用于体外培养的鸭肝细胞，试图阻止cccDNA的从头合成，于感染DHBV前日用5mmol/L丁酸钠处理鸭肝原代细胞，感染后第1天，实验组和对照组核内cccDNA水平相同，第2一6天对照组cccDNA持续上升，实验组未见上升，撤去丁酸钠后的3}4d内实验组cccDN.A水平才呈逐渐上升。此实验结果说明丁酸钠能可逆地阻断cccDN.A扩增，但不能阻止cccDNA从头合成。因此，在抗病毒治疗中，循环中的病毒体仍能感染肝细胞。在对慢性DHBV或}'HV感染模型的抗病毒治疗中，cccDNA浓度下降往往预示着受感染细胞数目的下降!i9-Col。综上所述，现有的抗病毒治疗尚不能阻止cccDNA的从头合成，cccDNA浓度的下降被假设认为是某些抗病毒药物阻断了cccDNA循环，在肝细胞死亡和有丝分裂过程中，cccDNA被稀释到较低水平tzu2.3小分子千扰RNA(siRNA)对cccDN.4的影响RNA干扰(siRNA)(smallinterferingRNA,siRNA))被广泛应用于诸多研究领领域，在抗病毒治疗、调节细胞增殖、凋亡、抑制致病基因表达等方面发挥作用。目前基因阻断主要在DNA和mRNA两个水平，包括基因敲除及DN.4陷阱、反义技术、肤核酸及RNA干扰(RNAinterferin,RNAi)cRNAi即利用双链RNA(doublestrandRNA,dsRNA)高效、特异性阻断特定基因表达，促使mRNA降解，诱导序列特异性的转录后基因沉默。启动步骤为dsRNA被111核酸酶RNA酶(Dicer)裂解成}z}_z“一核昔酸的指导RNA(guideRN'A)双链，进而整合人RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),RISC利用指导RNA确定细胞中的同源RNA序列并裂解之，从而阻碍细胞中特定基因的表达，达到诱导沉默的目的「zs-oMccaffrey等一z6一所用的、iRNA来源于含人U6启动因子的表达载体，体外实验分别于转染后王6,8d检测细胞培养液中的HBsAg量，结果发现HBsAg表达下降;体内用免疫缺陷小鼠构建HBV病毒血症模型，设计相应的siRNA予以治疗，结果显示治疗组小鼠HBsAg水平下降了84.5cIc，免疫组化显示对HBeAg的抑制达99%以上，提示RNAi在体内外均有高效、特异的抗病毒作用Shlomai与Shaul-z'发现针对HBV基因组的序列特异性的X-siRNA的表达载体与HBVDNA共转染细胞后，HBsAg降低60%。另外，Klein等zs一用，iRNA转染能表达HBV特异性转录物的小鼠，使小鼠HBsAg和cccDNA水平明显下降。siRNA抗HBV的优点在于其作用有序列特异、目的序列短小、可作用于多个靶位，抑制作用不依赖病毒复制。Jason等zy在HBV复制之前或在HBV感染的过程中使用RNA干扰来确定其对cccDNA的影响。HBV的复制起始于与HBV杆状病毒转导的HepG2细胞中，转导后10dHepG2细胞的再次培养产生一个可供HBV复制进行的系统;同时HBV从cccDNA大量表达从而刺激HBV的感染，HepG2细胞再与短发卡RNA(shRNA)转导并在HBV复制的起始阶段或慢性HBV复制的过程中表达杆状病毒;通过检测发现不论是在慢性感染之前还是过程中第8天的HBsAg,HBVRNA和DNA水平大大降低;但是cccDNA只有在开始感染之前加人、hRNA时才会受到影响。
作者认为RNAi可能在复制中间体和胞外DNA的水平上对HBV的复制和对感染过程中降低cccDNA的建立上具有治疗价值。就其机制而言，siRNA尚不能最终清除cccDNA，同时在基因传递、稳定性、毒性以及安全性等方面仍有很多问题有待解决30，但其作用的高效和特异性表明S1RNA作为一种高效抗HBV药物的潜能。
3清除cccDNA的影响因素
目前认为有两种免疫机制介导HBVcccDNA的清除，一是受染细胞通过细胞溶解机制被非受染细胞来源的细胞所取代，二是特异性细胞毒性T淋巴细胞对感染后肝细胞的清除。但有些受感染细胞内的cccNA既不复制也不表达蛋白，因而难以发挥特异性清除，使HBV持续存在难以彻底清除31。抗病毒治疗后肝细胞内。ccDNA的持续存在也是慢性乙型肝炎复发及疾病进展的重要原因。目前已知抗病毒靶点包括HBV进人肝细胞过程被许多分子抑制，如受体拮抗剂、特异性的抗HBV球蛋白等;HBV开放读码框转录被各种基于核酸的技术所阻断，如反义寡核昔酸(antisenseoli-gonucleotides)或siRNA以及病毒包装和分泌当前用于抗病毒治疗的药物有干扰素及核昔(酸)类似物两大类，其虽可将HBVDI\?A控制到检测不到甚至更低的水平，但尚不能直接清除cccDNA在病毒受到药物或宿主免疫的长期抑制病毒复制减少的情况下，成熟的核壳优先被利用补充核内cccDNA池;同时肝细胞外残留的病毒仍然有再次感染肝细胞的能力。最近，针对药物清除cccDNA的研究取得了一些进展，Cai等X32识别出两种二基磺胺化合物(DSS)，并发现这两种化合物在细胞培养中既不直接抑制HBVDNA的复制，也不降低病毒聚合酶的活性，但是能同时降低cccDNA和其假定前体DP-rcDNA(脱蛋白松弛环状DNA)的水平。
此外，Belloni等〔33」还通过核内。ccDNA微小染色体的表观遗传学调控在细胞培养和拟人化小鼠中揭示了IFN。抑制HBV转录和复制的分子机制，认为IFN。可以降低STATl和STAT2转录因子与活性cccDNA的结合，同时IFN。的抑制活性和干扰素刺激应答单元(ISRE密切相关，因为ISRE突变株转录少量的前基因组RNA并不受IFN。治疗的抑制。
综上所述，抗病毒治疗后细胞内HBVcccDNA的持续存在可能是慢性乙型肝炎复发的重要原因。减少HBVDNA进人细胞形成cccDNA池，阻止HBV感染细胞，提高宿主细胞免疫功能，促进cccDNA的清除是当前抗病毒治疗的研究方向。开展临床HBVcccDNA的检测对研究乙型肝炎慢性化机制、评价抗病毒疗效、预测肝炎复发等方面具有重要意义。

肝肠欲断

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newchinabok

人不辛苦，肝很辛苦

19721108

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