NVHLD2013]乙型肝炎病毒cccDNA：检测指标还是治疗靶标？
 缪晓辉 赵克开* 第二军医大学长征医院 *山东威海解放军第404医院
乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）是HBV复制的初始模板。其在肝细胞核内持续、稳定地存在，故被认为是HBV感染慢性化及抗HBV治疗停止后肝炎复发最主要的原因。近年来，随着以选择性实时荧光PCR技术为代表的各类cccDNA检测技术日渐成熟，以及临床医生对cccDNA检测临床意义的认识不断提高，cccDNA检测已从基础研究逐渐进入到临床应用。然而，慢性乙型肝炎抗病毒治疗不能达到彻底清除病毒的目的，皆因肝细胞核内乙肝病毒复制模版cccDNA不能被彻底清除，成为停药后复发，甚至耐药变异的根源，因此，只有清除肝细胞核内HBV cccDNA，才有实现治愈慢性乙型肝炎的目的。
一、HBV cccDNA分子结构特性及其意义
嗜肝DNA病毒基因组是一种松弛环状的双链DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）分子，其两条链均不是闭合的，其中负链较长，含有病毒基因组的全长基因，在其5ˊ起始端与3ˊ末端之间有一个数个碱基的“缺刻”(nick)；正链较短，有较大的“缺口” (gap)，其3ˊ末端不固定，故长度是可变的，约为负链长度的50%～100%。在病毒的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子（covalently closed circular DNA，cccDNA）。目前，无论是从分子机制研究乙肝病毒，还是从临床抗病毒角度观察疗效，建立的多种HBV cccDNA检测技术，均是利用了上述rcDNA与cccDNA在结构上的差异，从而可以在抽提肝组织或血清核酸时、在设计PCR引物时、在鉴定产物特异性时，可以有效地区分两种不同乙肝病毒基因。
cccDNA是嗜肝DNA病毒在肝内进行复制的原始模板，虽然其含量较少，但对病毒在宿主细胞内感染状态的建立以及维持病毒在细胞内的复制过程具有十分重要的意义。与rcDNA不同，cccDNA位于宿主肝细胞的细胞核而非细胞浆中。
病毒进入被感染细胞后，脱去外壳蛋白并释放出基因组DNA，即rcDNA，随后rcDNA进入宿主细胞核中转变成cccDNA分子，此即为cccDNA的“从头合成”(de novo synthesis)。rcDNA转变为cccDNA依赖的酶是宿主细胞内的酶而非病毒的DNA聚合酶。这是非常重要的提示，可以设想，任何试图阻止“从头合成”的干预手段，都必然会干扰细胞内业已存在的、维护细胞正常功能的酶。如果试图从cccDNA这个“源头”清除乙肝病毒，必须顾及宿主细胞的正常生理过程不受干扰。另外，从rcDNA变成cccDNA的过程，不只是两条链结构完整性的改变，还包括空间结构的改变，即超螺旋结构的形成，超螺旋结构的形成，需要具有解旋、拓扑异构等生物学活性的酶的参与，而这两种功能显然是病毒DNA聚合酶所不具备的，同样需要有宿主细胞“提供”，换言之，试图通过干扰这些酶的活性来清除cccDNA也要面临肝细胞自身功能被干扰的问题。
在合成子代病毒DNA的过程中形成第二链（正链）时，如果RNA引物不从DR1转位到DR2，而是从DR1位置开始引发原位引发（in-situ priming），形成的产物将不再是松弛环状的病毒基因组，而是双链线性DNA病毒基因组（dsl-DNA），dsl-DNA分子可以通过非同源重组的方式合成cccDNA分子，并仍能正常转录产生前基因组RNA，并再次通过非同源重组转化成新的cccDNA分子，但每次新形成的cccDNA分子在序列上都不同于母代cccDNA分子。嗜肝DNA病毒的这种方式又被称为非法复制（illegitimate replication）。与cccDNA从头合成方式相比，“非法复制”的发生率虽然较低，但它的影响可能并不弱，因为这也可能是病毒除点突变之外的逃避宿主免疫乃至药物选择压力的一种“异常”的变异方式。众所周知，乙肝病毒基因组在复制过程中，由于缺乏自身校对功能，因此，与选择压力无关的复制变异的不断积累，即导致感染者体内有大量复杂的基因组准种存在，以及多种基因型的存在。然而，这种非法复制，则可能是准种复杂和病毒变异度高的更为重要和复杂的因素。这对解决临床耐药问题有重要意义。
二、cccDNA作为检测与监测指标的可能性及意义
检测cccDNA的技术问题已经没有太大难度。国内较多研究者开展检测技术研究，发表了较多相关论文，少数临床检测试剂商甚至已经开发了cccDNA的检测试剂盒。本研究小组在国内较早开展cccDNA检测技术研究，十余年中积累了较多经验。本文讨论与检测相关的一些有争议的问题。
1.关于肝活检组织检测cccDNA。乙肝病毒基因组较小，仅3.2kb，以cccDNA的形式主要存在于肝细胞内，外周血单个核细胞中是否存在cccDNA一直有争议。而在肝细胞浆、血清（浆）、组织液，甚至其他组织器官中乙肝病毒基因组是以rcDNA的形式存在的，临床上乙肝病毒基因常规PCR定量或定性检测技术，均是以rcDNA为模板。若要检测cccDNA，则必须以肝组织为标本。肝脏活检是有创技术，有一定风险，并发症不可避免，技术要求也较高。在我国，某些城市和地区的某些较高级别的医院，可常规开展肝穿刺活检技术，而在绝大多数医院并非常规。另外，一次穿刺很难获得大量标本，所获得的肝组织标本的直径或长度均受到限制。标本既要做常规病理观察，还可能要做免疫组化，若再用于检测cccDNA标本量显然不足。因此，以肝组织为标本检测cccDNA的难度较大。
2.关于PBMCs作为替代检测标本。PBMCs常常作为某些病原分子或免疫分子检验或检测的“替代”标本，其取材的便利度介于血清和肝组织之间。然而，如前所述PBMCs中是否存在HBV cccDNA尚无定论，我们的前期研究未能在PBMCs检出cccDNA，因此，如果试图以PBMCs为标本来检测cccDNA是有很大“风险”的，现阶段也是不可能常规化的。
3.关于严重肝病患者血清中是否出现cccDNA。乙肝病毒感染者病情的差异很大，从疾病阶段上讲，包括了携带者、慢乙肝活动期、肝硬化代偿期或失代偿期、肝癌；从疾病严重程度上讲，可表现为轻、中、重，以及重型肝炎，那么这些差异是否可以通过检测cccDNA来甄别？我们曾经推测，在慢乙肝重度向重型肝炎发展的某个特定的阶段，由于大量肝细胞坏死，细胞核内cccDNA可能会大量释放入血，此时有可能从血清中被检出，并以此作为判定乙型肝炎重症化的可靠指标。然而，该研究未能获得预期的结果：未能在重症肝炎前期或重症肝炎患者的血清中检出cccDNA。
4.关于cccDNA与核苷类药物耐药变异。我们采用选择性荧光PCR及产物直接测序法，对40例慢性HBV感染者行肝移植前的肝组织内cccDNA耐药变异情况进行了检测，结果共在4例使用过拉米夫定的患者肝组织检测到cccDNA耐药变异。其中2例患者cccDNA发生rtM204I变异，且肝内rcDNA和血清HBV DNA亦发生相应的变异。另有1例患者肝内cccDNA、rcDNA存在rtM204I变异，1例肝内cccDNA、rcDNA存在rtQ215H变异，但二者血清HBV DNA却未检测到相应变异。另外，我们还在85例未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者中，发现2例患者存在cccDNA 自然变异。其中1例为rtM204I变异，另1例为rtV214A变异，且肝组织内rcDNA与血清HBV DNA中也存在相同的变异。我们进一步对上述检出cccDNA自然变异患者的肝组织cccDNA和rcDNA、血清HBV DNA标本进行PCR克隆测序分析， 结果显示，肝内cccDNA耐药相关位点自然变异实际上为变异株与野生株混合存在，但以变异株为优势株，但肝内cccDNA、rcDNA及血清HBV DNA的变异株和野生株比例并不一致。
5.关于cccDNA清除与抗病毒治疗终点。目前被普遍认同的观点是：任何抗病毒治疗措施，即使最终发生了HBsAg血清转换，病毒依然在肝内复制，只有完全清除了肝细胞核内的cccDNA才能实现彻底治愈，因为cccDNA是乙肝病毒复制的原始模板。
现有的抗病毒药物对肝细胞内cccDNA的影响较为有限。有作者分别研究了聚乙二醇干扰素+阿德福韦酯、拉米夫定或聚乙二醇干扰素+拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦等对慢乙肝患者肝细胞内cccDNA的影响，结果显示这些药物在有限疗程内均不能清除cccDNA。尽管如此，抗HBV治疗后肝组织内cccDNA的含量可以作为慢乙肝患者获得持久病毒学应答（sustained virological response， SVR）的重要预测指标。有限研究揭示了一点，即通过长期抑制体内乙肝病毒复制，使得肝细胞核中形成cccDNA的原料逐步减少，新的cccDNA分子得不到进一步补充，而老一代cccDNA分子也逐渐衰减。因此，长期抗病毒治疗（尤其是采用核苷类药物抗病毒）的最终结果就是逐渐耗竭肝细胞内cccDNA，这对于减少停药后肝炎复发有意义。抗病毒治疗后究竟需多长时间能耗竭cccDNA，目前尚缺乏有说服力的研究证据。有学者根据阿德福韦酯治疗慢乙肝患者1年后细胞内cccDNA含量的变化，推算出完全清除细胞内cccDNA大约需要14.5年。然而，该结论的依据并非来自可靠的数学模型。
6.关于HBsAg含量监测作为cccDNA清除指标。近年来HBsAg定量检测技术发展很快，技术本身已经成熟，临床应用也很广泛，尤其是用于预测抗乙肝病毒的疗效，引起学术界的广泛重视。但是HBsAg含量的动态变化是否与cccDNA的清除呈正相关的关系一直是争议焦点。笔者认为，从以下三点可以否定这种关系：第一，HBV DNA阴性，且HBeAg阴性的HBV感染者体内一直维持较高水平HBsAg；第二，HBsAg含量变化与疗效一致性非常有限，因此，其定量价值被夸大；第三，从分子机制和乙肝病毒基因组循环机制看，HBsAg与cccDNA之间的直接或间接的量效关系是非常牵强的。故笔者不建议把HBsAg定量观察作为cccDNA是否被清除的替代指标。
三、cccDNA作为抗病毒治疗靶标的意义及其可能性
可获取的有关cccDNA作为抗病毒治疗靶标的研究资料非常有限。从乙肝病毒吸附于肝细胞膜到进入肝细胞浆，并释放出乙肝病毒rcDNA，到穿过核膜并形成cccDNA，再以cccDNA为原始模板转录为前基因组RNA（pgRNA），到再合成新的DNA分子，并在胞浆内包装成完整的乙肝病毒颗粒、释放入血，再感染其他肝细胞，上述过程是一个完整和连续的循环。据此可以推测，任何消灭肝外病毒、阻止病毒入胞或出胞，甚至干扰细胞核内转录过程的治疗设计思路，均是以rcDNA为靶标，注定不可能“根治”慢性乙型肝炎，除非等待漫长的“耗竭”。如果能阻止rcDNA进入肝细胞核，或者进入核内直接分解cccDNA分子，才能真正从源头清除乙肝病毒。从这种意义上讲，cccDNA是抗病毒治疗的最理想靶标。问题在于其可行性。
面临的困难之一：从rcDNA转变成cccDNA依赖细胞内的酶而不是病毒DNA聚合酶！这些酶包括外切核酸酶、DNA合成酶、拓扑异构酶等，换言之，若以cccDNA为靶标，就要以上述酶为靶标。很显然抑制或消除这些酶的活性不仅目前没有技术可能性，而且其“伤及无辜”的后果尚无法预测。
面临的困难之二：作为治疗药物，无论分子量大小，进入核内并有效发挥作用的可能性还很难预测。有人设想通过三链DNA技术，直接“静默”cccDNA分子，迄今没有获得预期的研究结果。
面临的困难之三：以干扰素为代表的、可能实现治愈乙肝的抗病毒药物，无论是免疫调节还是独立的抗病毒作用机制，其结果均是以牺牲感染了乙肝病毒的肝细胞为代价，因此，接受治疗者，肝脏代偿功能必须良好，肝脏潜在的修复能力必须强大，否则易发肝衰竭；另外，干扰素发挥作用还需要感染者机体免疫功能的配合，否则不能有效杀伤或清除被感染的肝细胞，这也是干扰素长期疗效停滞在30%左右的原因。
综上，乙型肝炎病毒cccDNA，无论是作为检验或监测指标，或者是作为根治慢性乙型肝炎的靶标，在理论、技术和实际操作方面都存在诸多未决的问题，难点和“疑点”也很多，需要加强研究
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发表于 2014-2-27 21:30