谈乙型肝炎病毒cccDNA检测的方法、问题和意义

newchinabok

谈乙型肝炎病毒cccDNA检测的方法、问题和意义

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（hepatitis B virus covalently closed circular DNA，HBV cccDNA）检测技术的研发以及应用价值的探讨，一直是相关领域的研究者们关注的热点问题。业已积累了大量研究资料，但仍存在不少有待完善的问题。作者等多年从事HBV cccDNA的基础和临床研究工作，取得了一些结果并较为深入地思考了一些问题。阐述如下。一、乙型肝炎病毒cccDNA检测技术的历史、现状与问题乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的发现与检测方法的建立始于上世纪80年代。Miller等[1]采用DNA电泳及Southern 杂交检测技术，首次证实慢性乙型肝炎患者肝组织内存在一种电泳带位置为2.0 kb 的HBV DNA分子，并在电镜下证实为大小约3.2kb的超螺旋DNA分子。20世纪90年代，PCR技术开始应用于cccDNA检测。Kock等[2]建立了选择性PCR cccDNA检测技术。Addison等[3]在此技术基础上引入将竞争PCR，初步实现了cccDNA的定量检测。本世纪初，香港学者He等[4]建立了选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA的技术，实现了真正意义上的定量检测，这一技术得到包括笔者在内的国内外不同学者的进一步完善[5,6]。此后，Shao等[7]建立了基于嵌合（chimeric primer）引物和实时荧光PCR的cccDNA检测技术；Wong等[8]建立了cccDNA的侵入分析法（Invader Assay）。当前cccDNA检测技术面临的主要问题是特异性和敏感度，争论很多，问题不少。笔者所在实验室在国内较早开展乙型肝炎病毒cccDNA（HBV cccDNA）检测技术研究，复习文献和研究过程中发现了一些引人深思的问题。比如：①国内外不少机构将所在实验室建立的技术用于药物临床试验，甚至临床标本的检测。但迄今为止，国内外尚无公认的、较稳定并得到相关部门正式批准的HBV cccDNA检测试剂盒问世；②采用相同或不同技术研究外周血单个核细胞内是否存在cccDNA，所得出结论截然相反[9-14]；③不少作者报告在慢性乙型肝炎的血清内检测到了高含量HBV cccDNA[15-18]，个别报告甚至高达107拷贝/ml[15] ！结果的可信度值得探讨；④越来越多的研究报告采用cccDNA定量检测结果比较或评价抗病毒药物疗效，但是鲜有作者关注cccDNA检测技术问题。二、建立HBV cccDNA检测技术的难点建立cccDNA检测技术的最大难点在于体内有大量与cccDNA序列同源性较高的其他形式的HBV DNA存在，包括：①成熟病毒颗粒中的松弛、环状、双链DNA（relaxed circular DNA，rcDNA）分子；②在5％～10％的病毒颗粒中存在的双链线性DNA分子（double-strand linear DNA，dsl-DNA）[19, 20]；③由前基因组RNA（pregenomic RNA，pgRNA）逆转录形成的单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）；④细胞核内的cccDNA。难点之二在于细胞内cccDNA的含量较少。目前公认在已建立持续感染状态的肝细胞内，每个细胞内的cccDNA仅为5~50拷贝。尤为困难的是，在细胞内众多形式的HBV DNA中，cccDNA仅占总量的极小一部分。我们的研究表明同一患者肝细胞内总HBV DNA含量是cccDNA含量的10.7倍~9.2×105倍[11]。难点之三是如何获取用于HBV cccDNA检测标本。HBV cccDNA只存在于被感染细胞的核内，尚未在细胞浆内观察到HBV cccDNA的存在，那么HBV cccDNA是否通过细胞膜进入到细胞外就更难确定。因此，目前最可靠的cccDNA检测标本是肝脏组织。显然，肝组织的获取以及后续的分离纯化是比较困难的，尤其是试图动态观察，因此也导致临床广泛检测受限。三、现有HBV cccDNA检测技术的原理、缺陷及其解决办法选择性荧光定量PCR的设计原理是：由于rcDNA的正链和负链上均存在缺口，故可以设计跨越两个缺口的引物，使rcDNA不会被扩增，而cccDNA则可被选择性扩增。如模板为dsl-DNA或ssDNA，由于两条引物的方向相反，也不会被扩增。但是，在反应体系中rcDNA模板量较高时，以不完整的两条链为模板形成的单链延伸产物之间可自身退火（self-annealing）而导致假阳性结果[21]。Kock等[9]报告105 拷贝的rcDNA即可出现非特异的扩增产物，我们的经验也表明当HBV携带者血清病毒载量超过108拷贝/ml就会出现假阳性结果。更有甚者，有学者设计半套式PCR去检测PBMC中的cccDNA[12,13]，等于把这种非特异扩增的概率数万倍放大了！嵌合引物法和侵入分析法区分rcDNA和cccDNA的主要依据是rcDNA的正链不完整，因而嵌合引物或初始探针不能与之互补结合。但是，dsl-DNA分子用两种方法均是可以被扩增的。两种方法的检测低限为50拷贝/反应，相当于模板浓度为5×104拷贝/ml。由于dsl-DNA占总病毒基因组载量的5%～10%，当病毒载量超过5×105～1×106 拷贝/ml，就可出现病毒基因组“非特异”扩增而出呈假阳性。如何克服上述方法的缺陷，笔者认为需要把握两点：一是要通过反复实验，确定每一种方法能有效区分cccDNA和其他形式的HBV DNA的“安全”范围。如笔者实验室即通过反复实验，确定总HBV DNA在107拷贝/ml（含）以下时，单用选择性荧光定量方法检测cccDNA是可靠的，不会出现假阳性扩增。二是在“噪声”背景较高时，采取有效措施降低其他形式HBVDNA的含量，从而消除它们对cccDNA检测的影响。根据cccDNA本身的特殊性是可以提高检测特异性的。比如，根据cccDNA分布特点。cccDNA仅位于细胞核内，而其他几种DNA分子均位于细胞浆内，可采用细胞核分离技术，把细胞核分离出来进行cccDNA检测[22]。另外，其他三种DNA均位于核衣壳蛋白中，且末端与P蛋白共价结合，易于与十二烷基硫酸钠（SDS）结合，加氯化钾后即形成沉淀，通过离心可加以分离[9]。还有，cccDNA不能被一些酶如绿豆核酸酶(mung bean nuclease，MBN)、不降解质粒的ATP依赖DNA酶（Plasmid-Safe ATP-dependent DNase, PSAD）等降解，而其他形式的DNA可降解。笔者通过实验验证发现，上述第二、第三种方法，可使rcDNA等其他形式的HBV DNA降低一个数量级，而可保持cccDNA的含量不变。有学者对酶切方法处理用于cccDNA检测的标本提出质疑[23, 24]，主要考虑到增加酶切步骤，可能使标本稀释，同时酶切反应液中的成分也可能抑制PCR反应，会增加假阴性结果。我们认为这种担忧不成为重要问题。增加酶切步骤后，通过酶浓度的控制和设计反应体积，可以把cccDNA稀释度控制在2倍范围内，而PCR反应的结果是以对数级计算的；另外，笔者将MBN酶改为PSAD酶后，证实该酶对PCR没有抑制作用。敏感度不高是目前迫切需要解决的另一个问题。近年来，滚环扩增（rolling circle amplication，RCA）被用于检测微量核酸。RCA具有很强的扩增能力，据报告其检测灵敏度可达1拷贝/反应，等同甚至优于PCR[25]。鉴于RCA只能扩增环状DNA模板，因此最近有作者采用RCA技术检测cccDNA，结果表明该技术可有效区分rcDNA和cccDNA[26]。从理论上推测，ssDNA和dslDNA也不会被RCA扩增。值得注意的是：研究者并未介绍如何实现用该方法实现cccDNA的定量检测。如果以10倍梯度稀释的103~100拷贝的cccDNA为模板进行扩增，阴性血清对照及空白对照均有条带出现，尚需用HBV特异性探针进行Southern 杂交才能确认其特异性。四、正确认识开展cccDNA检测的临床意义目前国内外很多实验室从事HBV cccDNA研究，包括检测技术研发和应用价值研究，其意义是不言而喻的，对此我们曾给予评价[27]。但以下几个方面的问题仍需我们思考和进一步探索。一是抗病毒治疗究竟多长时间内才能清除肝细胞内的cccDNA。国内外的研究均显示，包括干扰素和核苷类药物在内的抗病毒药在短时间内均只能减少而不能清除cccDNA。国外有学者根据阿德福韦酯治疗慢乙肝患者1年后细胞内cccDNA含量的变化，推算出如果采用阿德福韦酯治疗，完全清除细胞内的cccDNA大约需要14.5年！[28,29]这一结论经常被学者引用，并以此说明长期乃至终身抗病毒治疗的必要性。事实上该结论的依据不够充分，推测的成分很大，而不是来自可信的数学模型。因为，到目前为止，抗病毒药物清除血液中的HBV 颗粒尚存在数种各不相同的动力学模型，关于它引起细胞内cccDNA减少的机制（推测为逐渐耗竭细胞内的rcDNA分子）及清除动力学模型更是不明确，又何来细胞内的cccDNA清除速度和时间呢？研究尚待深入！二是抗病毒治疗是否应该把清除cccDNA而非HBsAg作为治疗终点。有一个现象值得我们思索：HBV感染者经过抗病毒治疗后，即使发生血清HBsAg消失，肝细胞内仍有cccDNA存在[30]。提示抗病毒治疗后清除细胞内的cccDNA是十分困难的。由此还产生另一个问题，即在使用化疗药物或免疫抑制剂的情况下，此类患者是否再出现HBV的复制，导致乙型肝炎复发。可见，实现慢性乙型肝炎的治愈，应该以清除肝细胞核内的cccDNA为依据，但是清除cccDNA的一过程可能比较漫长，长期治疗还将必然伴随药物不良反应的增加，以及病毒耐药突变的增加。因此如要实现这个目标，可能会增加很大的社会和经济负担。三是血清中HBV cccDNA检测究竟价值如何？部分乙肝患者血清中有可能存在cccDNA，笔者实验室通过动物实验和临床研究已经证实。但评价血清中的HBV cccDNA的存在和含量有几个基本的事实不容回避：首先，就目前的认识水平而言，HBV cccDNA只存在于细胞核内，不会主动转运到胞浆和释放到细胞外，理论上只有严重的、足以导致肝细胞核破裂或溶解的损伤，cccDNA才有可能释放入血。其次，大量的研究已经证明，肝细胞核内的cccDNA由于某种调节机制的存在，其含量比较低并保持相对恒定，并非HBV的复制水平越高细胞核内的cccDNA含量越多。由此推测，即使血清病毒载量比较高，血清中cccDNA含量也不会相应增加。再次，相对于血液中众多的成分而言，3.2kb的HBV cccDNA毕竟是小分子，它在血液中不会有较长的半衰期（笔者实验室在动物实验中测定约为4.5小时左右），即使是在肝衰竭患者，也不是在病程的任何阶段可以在血液中检测到cccDNA的。最后，既然抗病毒治疗过程中肝细胞核内cccDNA下降如此之慢，血清中微量的cccDNA的变化又怎能明显，从而作为疗效评价指标呢？关注并开展HBV cccDNA的检测技术研究，深入了解cccDNA分子的结构与体内代谢过程，探讨cccDNA与病情转归、抗病毒疗效以及清除病毒效果的关系，这些都是具有重要意义的工作。但是近年来的研究进展相对缓慢，关键问题还在于检测技术不够成熟，必须尽快解决这一制约因素。 缪晓辉，赵克开（现在威海解放军404医院肝病中心工作）

newchinabok

抗病毒治疗究竟多长时间内才能清除肝细胞内的cccDNA?

StephenW

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现在抗病毒治疗(核苷酸药物)不能清除肝细胞内的cccDNA.干扰素和我们的免疫系统能清除肝细胞内的cccDNA.

感谢您的发帖, 请注明文章发表日期.

17017196

有一个现象值得我们思索：HBV感染者经过抗病毒治疗后，即使发生血清HBsAg消失，肝细胞内仍有cccDNA存在[30]。提示抗病毒治疗后清除细胞内的cccDNA是十分困难的。                 是我们的不幸运。

StephenW

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是我们的不幸运。激活是非常罕见的，而且可以再次被控制.

带状疱疹是由水痘带状疱疹病毒(Varicella zoster virus，VZV)引起的急性炎症性皮肤病，中医称为缠腰火龙、缠腰火丹，俗称蜘蛛疮、生蛇。其主要特点为簇集水泡，沿一侧周围神经作群集带状分布，伴有明显神经痛。初次感染表现为水痘，以后病毒可长期潜伏在脊髓后根神经节，免疫功能减弱可诱发水痘带状疱疹病毒可再度活动，生长繁殖，沿周围神经波及皮肤，发生带状疱疹。带状疱疹患者一般來說可获得对该病毒的终生免疫。

17017196

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谢谢你的回复，失望之余，多了一份安慰，有时常得自己太脆弱了！！

17017196

解放军302医院医学博士刘士敬（100039）自发清除乙肝病毒表面抗原的人不会再发病。