| 乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）是乙肝病毒前基因组RNA（pgRNA）的转录模板，对乙肝病毒的循环复制以及感染状态的建立均有十分重要的意义。从cccDNA的角度重新认识HBV感染和清除过程，有助于澄清现有的一些模糊概念，更深刻地理解HBV的致病机制，更理性地确定抗病毒治疗的策略和目标，并有可能在移植后肝炎复发的防治等更为深远的领域带来新的启迪。 1 关于HBV cccDNA的稳定性 1.1 cccDNA池是动态更新的
通常认为，HBV感染后肝细胞核内cccDNA池在数量上保持相对稳定；但是，这句话不应该被误解为——组成该池的cccDNA分子也是固定不变的。鸭肝细胞核内cccDNA的量受胞浆内包膜大蛋白水平调节，这是动态的负反馈平衡过程；作为负反馈调节的前提，构成cccDNA池的具体分子必须处于变化和更新当中，从头合成途径是cccDNA池补充和更新的主要方式[1]。HBV的自发突变率能够保持在与HIV相近的高水平、核苷类似物抗病毒治疗后的病毒变异等现象，足以表明cccDNA池是动态更新的。
1.2 cccDNA的转录活动
成年人肝脏内肝细胞总数约为2~3×1011个[2]，慢性感染状态下这些肝细胞受HBV感染的比例为5%~40%[3]；外周血病毒定量为108~1011拷贝/毫升的HBV感染者，肝脏每天要向外周血释放约1.3×101l~1.3×1014个病毒颗粒[4]；据此推算，每个受感染肝细胞每天释放到外周血的病毒颗粒数量约为3~3000个。每合成1个病毒颗粒所含的双链核酸即需要cccDNA完整转录1次；此外，每个病毒颗粒内尚含有1个病毒聚合酶，有约180个核壳蛋白、500个表面包膜蛋白（大、中、主），外周血中含核酸的完整病毒颗粒与管形颗粒、小球形颗粒的比例约为1：100：100，000——这些数量巨大的病毒蛋白均需由核内数量有限的cccDNA模板转录生成短寿命的mRNA翻译得来。这就意味着核内cccDNA分子其实是处于频繁转录过程中，在DNA拓扑异构酶作用下经常处于去超螺旋、解双链、转录后重新形成双链结构、再超螺旋化的动态变构过程中；HBV cccDNA作为病毒转录的模板，从来就不是“一池死水”。
1.3 cccDNA池究竟有多大？
既往认为，HBV感染后平均每个肝细胞核内含有的cccDNA数量在 6～60 之间。Zhang[5]等利用后天感染DHBV的成年鸭模型，收集从感染后第11天到第131天不同时点的肝脏标本，分离得到单独的肝细胞核，应用单细胞PCR扩增方法测出每个受感染细胞核内cccDNA 的量。结果发现90%受感染的鸭肝细胞核内cccDNA数量在1～17之间；各个细胞之间cccDNA池含量变化较大，不符合正态分布规律；同一个体在感染的不同时点测得cccDNA池含量也不相同，“平均值”波动在2.9～8.6之间；许多受感染肝细胞核内只有1个或数个cccDNA分子，并非通常认为的“cccDNA池”那么大。
该研究因为单独分离肝细胞核并排除了未被感染的细胞，真实反应了“cccDNA池”的大小；利用百分位数描述非正态分布数据，首次揭示了“cccDNA池”的分布规律。该研究小组还利用传统定量方法验证得到类似并且更低的结果（cccDNA池含量“平均值”波动在1.2～6.9之间）；另一研究小组在黑猩猩急性感染HBV活体模型中也计算得到类似的结果（平均10拷贝/细胞，在不同时间有波动）。实验方法的进步可以带来学术观念的更新：cccDNA池即使在数量上也是不稳定的——它既非以往认识的那么大，也非以往认为的那么稳，cccDNA池的概念及意义值得进一步探讨。
2 关于HBV cccDNA的清除动力学
既往我们过度关注慢性HBV感染与cccDNA的关系，却忽略了一个重要事实，即成年人感染HBV后绝大部分（90%～95%）都是急性自限性的过程。在此过程中，近乎100%的肝细胞都曾经感染过HBV，然而大部分被感染的肝细胞都通过非溶细胞途径清除了病毒[6]，或者说，在保全宿主细胞的同时清除了HBV cccDNA。这一过程不仅非常普遍，而且并不漫长（短于6个月？），深入研究其中机制，将为抗HBV治疗带来新的思路。
2.1 急性感染中HBV cccDNA的清除过程
Wieland等利用急性感染HBV的黑猩猩模型，全程观察了肝组织内HBV cccDNA的清除过程[7]。急性感染过程中肝细胞内HBV cccDNA数量迅速扩增，平均倍增时间约为3.8～4.2天，大约第7～9周时达峰（平均10拷贝/细胞）；肝细胞HBcAg阳性率增加过程与cccDNA基本同步或稍迟，最高可以达到99%。细胞内cccDNA的清除过程可以分为2个阶段：第一阶段为快速清除期（第8～12周），此期cccDNA清除速度远远快于HBcAg阳性细胞减少速度，表明这是一个非溶细胞性的cccDNA清除过程，并且绝大多数cccDNA在该阶段得到清除（约90%）；第二阶段为慢速清除期（第12周以后），考虑与CTL的细胞毒效应及肝细胞再生有关，仅约10%左右的cccDNA是在此阶段被清除。总体看来，初建感染状态时cccDNA优先于rcDNA扩增，提示cccDNA易由从头合成途径迅速补充；占总量90%的cccDNA可在很短时间内被消除，表明cccDNA存在快速耗竭通道。
随访发现，虽然2只猩猩均表现为急性自限性感染过程，临床症状和生化指标恢复正常，但是肝组织内仍残存有痕量的“cccDNA”；在慢性HBV感染者经抗病毒治疗后或是自发性的病毒清除过程中（血HBsAg和HBV DNA消失），也有着类似现象[8,9]。这些现象提示，可能自限性感染过程并不要求完全清除所有细胞内的HBV cccDNA；认识并认可这些现象，对于合理确立抗病毒治疗的策略和目标具有重要意义。
2.2 细胞内cccDNA的半衰期测定
在前述黑猩猩急性感染过程中，Wieland 等估算出cccDNA半衰期为9～14天。迄今为止，有关cccDNA半衰期研究的其他结果大致如下：
Civitic等在DHBV先天感染的原代培养鸭肝细胞中，用5-溴2-脱氧尿苷（BrUdR）标记cccDNA，测得cccDNA的半衰期平均为3～5天；Delaney等在转染了HBV DNA的HepG2细胞中应用拉米夫定抑制HBV复制过程，测得cccDNA半衰期为3天；Guo等在转染了DHBV的LMH细胞中应用拉米夫定抑制DHBV复制过程，测得cccDNA半衰期为48小时。
Addison等用拉米夫定治疗先天感染DHBV的北京鸭5个月，然后取肝脏活检发现5只鸭中有3只cccDNA水平呈指数下降，其半衰期长达35～57天，另2只70天内呈指数下降，但此后稳定在6拷贝/细胞的水平；Zhu等用L-FMAU治疗WHBV慢性感染的土拨鼠30周，测得cccDNA半衰期33～50天。
上述报道的结果相差甚远，既往曾把这一现象解释为宿主的“种属差异”。但是同为DHBV cccDNA，半衰期却有2～5天和35～57天两个不同层次；而DHBV和WHBV作为不同病毒，在鸭和土拨鼠这两种不同宿主中的半衰期却如此相近（35～57天、33～50天），这显然不是种属差异所能解释。进一步分析发现，较短的半衰期（2～5天）均是在体外培养的细胞中测得；较长的半衰期（33～57天）均是在活体肝脏中测得，可见不同的实验设计才是问题的关键。
2.3 cccDNA真有这么长的半衰期吗？
要获取细胞内cccDNA半衰期的准确数值，最重要的前提是确保在检测过程中没有新的cccDNA补充；或者，至少要证明新合成的cccDNA的量少到可以忽略不计。但是在具体的实验设计中，这一重要原则往往被忽视。
Addison等用拉米夫定治疗先天感染DHBV的北京鸭，5只鸭中有2只cccDNA水平先下降然后稳定在6拷贝/细胞的水平，这一现象表明：活体内药物未能有效阻止新生的cccDNA从头合成。核内cccDNA是由胞浆内rcDNA补充更新的，作者在文中用了大量篇幅证明血中HBV DNA已经被药物明显抑制（下降幅度可达5个数量级），可是对于细胞内rcDNA水平却只字未提。事实上，外周血中HBV DNA数量的明显减少并不代表肝细胞内的HBV DNA数量的同步减低。临床观察表明接受拉米夫定治疗1年的患者外周血HBV DNA水平下降至治疗前的1/330～1/1700，但是肝细胞内HBV DNA只下降至治疗前的2/3～1/3，细胞内病毒量并没有数量级上的变化[10]。单用拉米夫定或联合PEG-干扰素治疗1年的患者，外周血HBV DNA定量下降3.98～5.18个数量级，肝细胞内HBV DNA数量却只下降0.19～0.21个数量级（即治疗前的65%～61%），肝细胞内cccDNA下降了0.068～1.07数量级[11]。这些数据不仅可以解释现有的活体内cccDNA半衰期检测方法的局限性，也提示了目前抗HBV治疗的真正瓶颈所在。
综上所述，如果不能完全解决cccDNA半衰期测定技术的准确性问题，那么，应用现有文献资料描述的cccDNA半衰期数值去判断抗病毒治疗的效果就必须慎重，不能套用现有的cccDNA半衰期的概念和数值去预测抗病毒治疗的未来。
3 HBV cccDNA检测的假阳性
3.1 HBV DNA的非法复制过程
HBV DNA的复制是个逆转录过程：1）以pgRNA 为模板通过病毒P蛋白的逆转录活性合成HBV rcDNA 负链，同时pgRNA经由P蛋白的RNA酶H活性逐渐降解（残留5’端长度为18nt的寡聚帽状核苷酸）；2）pgRNA 5’端残留的18nt的寡聚核苷酸转位到负链近5’端DR2区域，以其末端12nt的序列与负链DR2区域互补结合并作为引物开始合成rcDNA正链。上述过程2）中，正链引物正确转位到DR2位置（转位引发，translocation priming）是保证HBV DNA分子形成正常的松弛环状结构（rcDNA）的关键。若正链引物从DR1位置引发（原位引发，in situ priming），产物HBV DNA分子为线性双链，与相应的rcDNA分子在序列结构上有重要区别。原位引发现象又被称为非法复制（illegitimate replication），可占细胞内HBV复制过程的5%～20%；相应的线性双链分子产物可以正确包装、分泌到细胞外并能感染新的细胞[12,13]。因为病毒频繁复制的巨大基数，经由非法复制途径产生的线性双链绝对数量并不算少，是感染后人肝细胞内HBV DNA的主要存在形式之一[14]，已经足以干扰某些特异性检测cccDNA的方法并带来致命的假阳性。
3.2 假阳性的产生机制及控制方法
目前用于cccDNA特异性检测的方法主要有三种，究其策略都是利用cccDNA区别于rcDNA和其它复制中间体、异质性复制产物的结构连续性差异，从而实现检测的特异性。
Invader方法[15]能够区分HBV rcDNA，有赖于rcDNA分子在正链5’末端的“截断”特征。遗憾的是，由于前述非法复制过程及相应的线性双链分子产物在该处的结构特征完全等同于cccDNA分子，产生了致命的假阳性，尤其是在用于检测肝细胞内cccDNA时。
嵌合引物（chimeric primer）法[16]的特异性同样有赖于正链5’末端的“截断”特征，也具有上述假阳性可能。并且，在第一步单链延伸过程中，正链末端本身也可以作为引物引发合成无截断特征的正链序列，在高丰度的rcDNA存在时这种假阳性更易出现。
经典的跨rcDNA双缺口PCR策略沿用已久，非法复制过程产生的线性双链分子不会造成假阳性；但是当有高丰度的rcDNA存在时，因为正链和负链不完全延伸产物的自退火（self-annealing）现象，也会有假阳性发生。至于某些简化的跨单缺口PCR策略，几乎没有特异性。
解决上述假阳性问题有赖于对相应机制的深刻理解。对于Invader方法和嵌合引物法，应该完全去除核酸抽提产物中的线性双链成分，这是很难实现的；幸而跨双缺口的方法不会因线性双链分子产生假阳性。我们的数学模型评估和实时荧光定量PCR方法验证表明，跨双缺口方法中rcDNA丰度必须低于103拷贝/PCR反应才能有效避免假阳性的发生。单独应用Hirt分离法（Hirt Fractionation）或选择性酶切方法并不能确保rcDNA丰度降至假阳性阈值以下，有效避免跨双缺口策略中的假阳性问题需要严格的定量控制措施。
3.3 现有文献中的假阳性问题
任何一位作者在发表研究结果时，都应该阐明他所用方法的假阳性机制并详细解释控制措施；实验设计中必须设立含有高丰度rcDNA的阴性对照，每份样品和对照都应该进行“rcDNA”定量检测以判断有无假阳性可能。遗憾的是，众多的建立cccDNA特异性检测方法的文章、关于外周血单个核细胞（PBMCs）中检测到cccDNA的文章、关于血清中检测到cccDNA甚至和病情复发相关的文章都没有讨论各自方法的假阳性问题，更无相应的控制措施。迄今为止，只有Kock等[17]关于PBMCs中不存在cccDNA的文章符合严格的对照原则。感兴趣的读者研读或引用该类结论时，需特别留意关于假阳性的评价。
4 小结与展望
HBV“肝外储存池”研究的核心内容在于判断病毒能否在特定细胞中维持完整的复制过程，cccDNA检测可以作为重要标志。但是对于cccDNA各种检测方法的假阳性问题，学术界一直没有给予足够的重视，由于技术问题带来的假阳性结果以及由此而得出的错误结论，可能会误导我们的认识，不可掉以轻心。
急性自限性HBV感染过程中，病毒清除主要是通过非溶细胞性途径进行的；这一过程的广泛性和短暂性，提示我们cccDNA其实是可以迅速消除的，清除核内cccDNA并非我们想象中的那么困难。现有抗病毒药物产生临床效益的机制可能仅限于抑制/防止病毒释放入血，与此相应地减少了致病抗原/表位的分泌和提呈，但是还远未达到明显抑制/清除细胞内HBV复制的效果，更谈不上“耗竭”cccDNA。如果将细胞内HBV视作满桶的水，现有的抗病毒治疗减少或防止了水的外溢（这也是致病抗原/表位的提呈过程）从而减轻了免疫致病性；但是桶内的水并没有明显变化（数量级！），更谈不上桶底cccDNA的减少了。这一设想在肯定现有抗病毒治疗的有限效果并探讨其有效机制的同时，也让我们看到了未来抗病毒治疗的广阔天地。从细胞内HBV DNA（rcDNA + cccDNA），而不仅仅是血清中HBV DNA的角度评价抗HBV药物和各种方案的疗效，面临的不仅是挑战，更多的是机遇。
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发表于 2014-2-26 16:11
