乙肝受体：五年心血“钓出来的”

javeping

身为一名病毒学家，李文辉用“钓鱼”来形容自己的工作。

　　这位垂钓者的目标，是乙型肝炎病毒（HBV）的受体。这种细胞表面的受体分子，是乙肝病毒及其卫星病毒丁型肝炎病毒（HDV）入侵人体所需打开的一把锁。找到这把锁，将有助于深入了解乙肝病毒的感染机制，并为治疗乙肝及其相关疾病提供钥匙。

　　经过5年的研究，这位北京生命科学研究所的研究员和学生们一起，钓到了这条大鱼。研究成果发表在11月13日的《eLife》杂志上，题为《钠离子牛磺胆酸共转运多肽是乙型肝炎和丁型肝炎病毒功能性受体》。

　　“这一开创性的研究成果是有史以来本领域最优秀的科研论文之一，将重塑乙肝病毒研究领域现行的研究模式。”乙肝病毒侵入研究领域的顶尖专家、德国海德堡大学史蒂芬·伍本教授告诉中国青年报记者。他同时评价创刊不久的《eLife》是一份具有很高水准的期刊。

　　对此，“渔翁”李文辉谦虚地表示：“能对这一领域做出改变，这是最值得我们高兴的事。”

　　寻找受体就像大海捞鱼，而且是有目的只钓某个品种的鱼——能够与乙肝病毒相结合的鱼

　　“寻找受体就像大海捞鱼，而且是有目的只钓某个品种的鱼——能够与乙肝病毒相结合的鱼。”论文的并列第一作者钟国才打比方说。在乙肝病毒发现至今的40多年里，全球科学家一直希望捕获这条大鱼，但都以失败告终。

　　这也是乙肝至今逍遥法外的原因之一。目前，全世界大约有3.5亿名慢性乙肝患者，其中1500万人同时感染了丁型肝炎病毒。作为“乙肝大国”，我国大约有1.2亿乙肝病毒携带者，其中慢性乙肝病人3000万，每年约35万人死于慢性乙肝相关疾病。

　　早在哈佛大学医学院研究传染性非典型性肺炎病毒（SARS）时，李文辉就对这条漏网之鱼产生了浓厚的兴趣。早年在医院见习时，他目睹了乙肝患者的种种痛苦。2007年回国后，这位博士到北京生命科学研究所工作，决心找到乙肝受体。

　　他所带领的研究团队从树鼩着手。这种长相颇似松鼠的哺乳动物，是除人类和黑猩猩以外唯一能被乙肝病毒感染的物种。

　　起初，北京生命科学研究所没有树鼩专用的动物房，这群小家伙只能住在实验室旁边的一个小房间里。来自北京协和医学院的博士研究生何文辉当起了保姆。这个大男孩负责树鼩的饮食、卫生，以及居住室温的调节。更为重要的是，他要给树鼩动手术，取出肝脏细胞，进行体外培养。

　　时至今日，他还记得在2008年汶川大地震发生时，一只机灵的树鼩从笼子里跑出来。他和李文辉不得不满屋子捉树鼩，“却没有发现其他人早已经跑到了楼下”。

　　正是这群毛茸茸的小动物，在“钓鱼”过程中立了大功，它们提供的基因表达图谱是对钓上来的鱼的重要参考。结合过往几代科学家对乙肝病毒的认识，李文辉实验室的研究人员对乙肝病毒表面一段特殊的氨基酸序列——鱼饵——进行了特殊设计，将其变成病毒受体最喜欢的口味。

　　面对这条稀有且狡猾的大鱼，研究人员还研发出特制的渔具：装入非天然氨基酸，这相当于鱼钩中的倒钩，以避免上钩的大鱼逃脱。

　　除了美味的鱼饵和合适的鱼钩，结实耐用的鱼线也是必备武器。李文辉率领的团队使用了生物素——它可以将上钩的大鱼从茫茫大海中拽出来。但另一个问题随之而来，这些捞出来的猎物，大部分都是海藻、小虾之类的东西。当时，在哈佛大学医学院抗体专家隋建华的帮助下，研究人员又充分利用了乙肝病毒基因序列本身存在的另一个标签：单克隆抗体表位。这个标签相当于另一种更适合的鱼饵，抗体相当于鱼线，从海里捞出来的鱼再用这种鱼饵钓一遍，那钓到乙肝病毒受体这条鱼的可能性就大大增加了。

　　一条名叫肝脏胆酸转运蛋白、又名钠离子-牛磺胆酸共转运多肽的大鱼终于浮出水面了

　　经过精细的准备和耐心的等待，一条名叫肝脏胆酸转运蛋白（NTCP）、又名钠离子-牛磺胆酸共转运多肽的大鱼终于浮出水面了。正是这个家伙与乙肝病毒表面包膜大蛋白的关键受体结合区发生特异性相互作用，从而打开了入侵细胞的大门。

　　关于这种相互作用，李文辉解释说，如果把乙肝病毒比喻成钥匙，受体分子就是安装在宿主细胞上的一把锁。病毒只能用自己的钥匙打开受体的锁进入房间，才能最终侵入宿主细胞，并感染细胞。

　　“但是病毒与受体在什么时间点结合，什么时候释放，需要多长时间才能打开锁，那扇门是弹簧门、双扇门还是其它门，我们还需要进一步确认。”李文辉表示。目前的研究只能证明，乙肝病毒和受体结合之后打开这扇门，需要的时间比较长。

　　在长达5年的研究过程中，这个实验室几乎没有发表过论文。“因为中间实验有很多的不确定性，未来的结果也难以判断。”这位戴眼镜的研究员说，“就像长跑一样，中间的坚持阶段最困难。”

　　起初，研究团队中的何文辉和女博士后徐广伟取乙肝病毒的重要的一段作为鱼饵，但是捕捞效果并不理想。这使大家逐渐认识到，需要为受体这条大鱼装入精心设计，最好不能解离的倒钩，如非天然氨基酸，为避免煮熟的鸭子飞了。

　　与此同时，钟国才采用了另外一种方式：拿渔网去捞鱼。因为有些细胞可以感染乙肝，有些细胞不能，通过比较这两种细胞不同的蛋白表达差异，可以缩小范围。一开始是两万个基因，后来被缩小到150个，再从中筛选出60个可能基因，最后用遗传学的方法把这60个基因挨个审查。“这种方法从原理的角度来讲是可以的，但是除了这个要寻找的受体之外，还有一些其它基因也有效果，所以难以进行最后的确认。”钟国才解释说。

　　距离大鱼上钩越来越逼近了，实验室的氛围也越来越紧张。由于徐广伟经常熬夜甚至通宵，实验室专门为她添置了一张折叠床。钟国才夜里零点以后从实验室出来，出大楼的时候需要进行登记，他发现，登记本上一列下来基本都是实验室的同事。

　　另一位“钓鱼者”严欢也在寻找受体的队伍之中。他是论文第一作者、北京大学生命科学院的博士生。他的研究方向是从丁型肝炎的角度来研究乙肝。在他看来，丁肝就是“披着羊皮的狼”——它与乙肝病毒共用一个外壳，用的很可能是同样的受体，拿下丁肝，距离发现受体也不远了。

　　直到2011年的初夏，他们在与相关老师和朋友交流之后，受到启发，严欢在病毒基因序列上植入非天然氨基酸光敏亮氨酸。这意味着给鱼钩加个倒钩，以防止咬钩的鱼又溜走。

　　但是，他连钓了3个月的受体也没有效果。“经常夜里两三点才睡觉，有时甚至通宵”。“那3个月完全是白做了，当时非常沮丧。”严欢想起那段日子，“但为了这个重大发现，我至少得坚持半年。”

　　后来，通过减少鱼钩的数量，实验逐渐顺利起来。2012年的元旦前，含量最高并且最“靠谱”的受体，在“鱼类鉴定行家”景致毅等的帮助下，慢慢浮出水面。

　　元旦后的第二天，严欢这个严谨的科学工作者，和女朋友一起来到雍和宫，拜佛许愿，祈祷他早日发现乙肝病毒的受体。

　　这就是我们苦苦寻觅的那条大鱼

　　兔年的除夕夜，严欢和钟国才、徐广伟等人一起在实验室里度过。正月初六凌晨3点多，正在焦急等待的李文辉接到他激动的电话：“我拿到了丁肝受体的‘金标准’！ 确定了NTCP确实是我们在找的那条鱼！”那天晚上，他将受体导入到原来本不能感染丁肝病毒的肝癌细胞里，癌细胞也感染了丁肝病毒。通过整个团队的努力，类似的结果也在乙肝的系统中实现了。

　　“一般我们要验证一个东西，通常有两种方式，一个是功能获得实验，一个是功能丧失实验。”严欢说，“我首先在丁肝病毒的功能获得实验上取得了成功。”乙肝病毒的功能获得难度相对更大,但没过多久钟国才把这个问题也解决了。

　　另一方面，由钟国才和徐广伟等人完成的功能丧失实验，也获得了成功。这就意味着“分别从充分性和必要性验证了那就是我们想要的受体”。

　　“很幸运我们坚持做下来了。好在包括我在内，大多数同学天性还是比较乐观的。”李文辉想起5年的坚持感慨道，“只是，终点在哪里当时还不知道。”

　　就在今年严欢女友25岁生日那天，他和女朋友一起去民政局领了结婚证，“光荣‘裸婚’，婚纱照什么的都免了”。钟国才的爱人，也放弃了最喜欢的临床医生的工作，来到实验室，做了一名普通的技术员。

　　就像乙肝病毒受体的发现过程一样，论文的投递过程也是一波三折，曾一度让研究团队情绪十分低落。李文辉鼓励大家：“这没有关系，只要我们能真的做出一些发现，做出一些改变，我们完全可以为自己骄傲。”

　　最终，《eLife》接纳了这篇研究论文。这家由美国霍华德·休斯医学研究所、德国马普学会和英国维康基金会共同创办的杂志，被认为将来具有和《自然》杂志相抗衡的实力。德国国家医学病毒所的迭特·格利布对中国青年报记者表示，《eLife》杂志在成为生命科学领域的顶尖学术期刊上，极具潜力。

　　11月13日，论文发表的那一天，伍本第一时间向李文辉表达了祝贺：“我曾以为我们能够第一个发表这项研究成果，但是事实上你们赢得了这场赛跑。我们对此并不嫉妒，而是衷心地祝贺，我们都将受益于此，尤其那些患者。”

tonychant

李文辉 博士
北京生命科学研究所研究员
Wenhui Li, Ph.D.
Assistant Investigator, NIBS, Beijing, China

Phone：010-80726688-8580
Fax：   010-80726689
E-mail：[email protected]



教育经历

Education

1994
兰州医学院 医学学士学位


Lanzhou Medical College

(School of Medicine, Lanzhou University)

Bachelor Degree of Medicine

1997
兰州生物制品研究所 免疫学硕士学位


Lanzhou Institute of Biological Products

M.S. in Immunology

2001
中国协和医科大学 中国医学科学院 基础医学研究所 病原生物学博士学位


Institute of Basic Medical Sciences

Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences

Ph.D. in Pathogenic Biology


工作经历

Professional Experience

2007-
北京生命科学研究所 研究员


Assistant Investigator, National Institute of Biological Sciences,

Beijing

2004-2007
哈佛大学医学院 Instructor


Harvard Medical School, Boston

2001-2004
哈佛大学医学院 博士后


Postdoctoral Fellow, Harvard Medical School, Boston

1997-1998
兰州生物制品研究所 研究助理


Research Assistant, Lanzhou Institute of Biological Products, Lanzhou


研究概述

Research Description


本实验室的主要研究兴趣为囊膜病毒侵入细胞及相关过程的分子机制。病毒侵入细胞起始于与细胞表面受体的结合。围绕这一过程，我们希望探索：病毒细胞受体分子的识别；病毒受体是如何介导病毒感染的；其它胞内因子是如何参与病毒侵入的；病毒蛋白是如何进行免疫逃逸的；如何有效地抑制病毒的感染，等。我们综合运用病毒学，生物化学，化学生物学等多学科方法，以回答上述问题。这些研究将有利于深化对于病毒基本生物学，及病毒与感染宿主相互作用的认识与理解，并且有助于开发有效的抗病毒制剂及新型疫苗。

乙型肝炎是危害人类健康的严重传染病，是导致肝硬化、肝癌的重要病因。我们最近成功地发现并确认了人类乙型肝炎病毒，及其密切相关的丁型肝炎病毒感染肝细胞所必需的功能受体分子是肝细胞膜上的钠离子-牛磺胆酸-协同转运蛋白（NTCP）。这一重要发现为进一步深入研究乙肝病毒及相关致病机制打开了新的大门，并为研发新的药物和治疗手段提供了可能。

Our lab tries to understand the entry mechanisms of enveloped viruses. Regardless of the type of enveloped virus, the initial step of viral entry always involves the interactions between the viral envelope protein(s) and viral receptor(s) on host cells. The questions that we are mostly interested in are: what is the specific cellular receptor for a virus? How does the receptor contribute to viral entry? How does the viral entry protein evade the host immune response? How can viral infection be inhibited by entry inhibitor or host immunity. We seek to identify the receptors and elucidate the entry processes of viral pathogens important to human health. Knowledge of viral entry mechanisms will deepen our understanding of basic biology of viruses and their host cells, and offer new opportunities to develop more efficient inhibitors against the infections and new generation of viral vaccines.

Hepatitis B virus (HBV) infection and its associated cirrhosis and hepatocellular carcinoma cause about one million deaths annually. The molecular mechanisms by which HBV and its satellite virus Hepatitis D virus (HDV) infect human liver have been elusive. By taking state-of-the-art affinity purification approach, we recently identified sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP), a liver bile acid transporter, as a specific receptor for HBV and HDV. NTCP binds to a critical receptor binding region of viral envelope L protein and contributes substantially to the efficiency of HBV and HDV infections. This finding advances our understanding of the HBV and HDV infection and may lead to new strategies for prevention and treatment of these viral infections and associated diseases.


发表文章

Publications

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Li W, Sui J, Huang IC, Kuhn JH, Radoshitzky SR, Marasco WA, Choe H, Farzan M.The S proteins of human coronavirus NL63 and severe acute respiratory syndrome coronavirus bind overlapping regions of ACE2. Virology. 2007; doi:10.1016/j.virol.2007.04.035

2.
Radoshitzky SR, Abraham J, Spiropoulou CF, Kuhn JH, Nguyen D, Li W, Nagel J, Schmidt PJ, Nunberg JH, Andrews NC, Farzan M, Choe H. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 2007;446(7131):92-6.

3.
Kuhn JH, Li W, Radoshitzky SR, Choe H, Farzan M. Severe acute respiratory syndrome coronavirus entry as a target of antiviral therapies. Antiviral Therapy. 2007, 12:639-650 review

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Li F, Berardi M, Li W, Farzan M, Dormitzer PR, Harrison SC. Conformational states of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein ectodomain. J Virol. 2006, 80(14): 6794-800.

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6.
Li W, Wong SK, Li F, Kuhn JH, Huang IC, Choe H, Farzan M. Animal origins of the severe acute respiratory syndrome coronavirus: insight from ACE2-S-protein interactions. J Virol. 2006,80(9):4211-9 review

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Kuhn JH, Radoshitzky SR, Guth AC, Warfield KL, Li W, Vincent MJ, Towner JS, Nichol ST, Bavari S, Choe H, Aman MJ, Farzan M. Conserved receptor-binding domains of Lake Victoria marburgvirus and Zaire ebolavirus bind a common receptor. J Biol Chem. 2006,281(23):15951-8.

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Huang IC, Bosch BJ, Li F, Li W, Lee KH, Ghiran S, Vasilieva N, Dermody TS, Harrison SC, Dormitzer PR, Farzan M, Rottier PJ, Choe H. SARS coronavirus, but not human coronavirus NL63, utilizes cathepsin L to infect ACE2-expressing cells. J Biol Chem. 2006,281(6):3198-203.

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9病成医

将来的诺贝尔医学奖是否会落到这几个人头上?