| 病毒性肝炎领域的基因组研究进展 -----Genomic Research Updates in Viral Hepatitis
来源： 作者：王瑜伟|黄爱龙 发布时间：2012-3-28 14:42:55 阅读：24
人类基因组计划、“曼哈顿”原子弹计划、“阿波罗”登月计划并称为20世纪人类自然科学史上的三大奇迹。人类基因组计划的提出与实施，促进了一个新的学科的产生——基因组学（Genomics）。基因组学是研究生物基因组以及如何利用基因的一门学问，用于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学分支。
 ■王瑜伟 黄爱龙 重庆医科大学
人类基因组计划、“曼哈顿”原子弹计划、“阿波罗”登月计划并称为20世纪人类自然科学史上的三大奇迹。人类基因组计划的提出与实施，促进了一个新的学科的产生——基因组学（Genomics）。基因组学是研究生物基因组以及如何利用基因的一门学问，用于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学分支。基因组学主要研究生物体内基因组的分子特征，以整个基因组为研究对象，而不是以单个基因为单位作为研究对象。该学科提供基因组信息以及相关数据系统，试图解决生物、医学和工业领域的重大问题。基因组研究包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学。2001年，人类基因组计划公布的人类基因组草图，为基因组学研究揭开了帷幕。
基因测序技术发展
基因组包含了一个生物体的所有遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。基因测序技术是基因组研究最重要的工具，它的发展经历了三个主要阶段。
第一代测序技术阶段
1977年，Sanger等提出了经典的双脱氧核苷酸末端终止测序法。该方法的原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此可用于中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。此后，在Sanger法的基础上，20世纪80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪。此外，90年代中期出现的毛细管电泳技术使得测序的通量大为提高。
第二代测序技术阶段
2005年后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术不仅保持了高准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度。第二代测序技术（高通量测序技术）是对传统测序技术的革命性改变，可一次性地对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术（Next Generation Sequencing），足见其划时代意义。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（Deep Sequencing）。
●Roche 454测序技术
2005年底，454公司推出了基于焦磷酸测序法的高通量基因组测序系统Genome Sequencer 20 System。这一技术的建立开创了边合成边测序（Sequencing by Synthesis）的先河，被Nature杂志以“里程碑事件”报道。目前，Roche 454 GS FLX Titanium每次运行能产生100万条序列，平均读长能达到400碱基（nt），且第400个碱基的准确率能达到99%。一次运行所需时间为10 h，能获得4亿~6亿个碱基的序列信息。
●Illumina Solexa测序技术
Illumina公司的第二代测序仪，利用其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结”（Reversible Terminator），实现自动化样本制备和大规模并行测序。2010年初，Illumina公司将其第二代测序仪Genome AnalyzerⅡⅩ升级到HiSeq 2000。HiSeq 2000含有两张Flow cell，可同时运行或只运行其中一张，读长为100 nt，每次运行最多可产生200 GB的数据量（读长为2x100 nt）。
●ABI SOLiD测序技术
美国应用生物系统公司（ABI）于2007年底推出了SOLiD 第二代测序平台。它的独特之处在于它以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应为基础，而不采用传统的边合成边测序技术。连接反应避免了DNA聚合酶合成过程中常有的错配问题，而SOLiD特有的“双色球编码技术”又提供了一个纠错机制，这样设计上的优势使得SOLiD在系统准确性上大大领先于其他它平台。单次运行能得到的最大数据量为300 Gb。测序的系统准确性能达到99.99%。
第三代测序技术阶段
近期出现的Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，它们最大的特点是单分子测序（不需要进行PCR扩增）。其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。
深度测序在HBV、HCV感染中的研究进展及展望
深度测序在HIV感染已有较多应用。在抗HIV治疗过程中，劣势株在药物选择压力下会转变为优势株，低频耐药位点在选择压力下逐渐成为优势序列，最终导致治疗失败。研究人员利用454测序技术对HIV病毒基因进行测序，在未用药的标本中也发现了低频率的耐药位点，为HIV抗病毒药物治疗奠定了理论基础。深度测序在肝炎病毒特别是HBV和HCV感染中的研究也有了一些新的进展。
HBV感染
2009年，意大利的研究人员用454的UDPS（Ultradeep Pyrosequencing）测序技术对13例HBV感染患者标本的RT区进行测序。这13例患者中5例未用过核苷（酸）类似物（NA），8例使用NA，其中9例D型，4例A型。结果共获得128，184条序列，平均读长为189 bp。每个标本的读数在2852~18016之间。这个数据量数倍于常规的克隆测序。通过对大量数据的生物信息学分析得到如下结果：在使用NA和未使用NA的患者中，D型比A型的基因序列呈现出更高的异质性。在耐药位点的检测中，UDPS可以直接检测<24%的耐药位点，而Sanger法测序无法检出耐药位点比例介于2%~8%、LiPA未能检测的部分标本，UDPS都可以检出。另外，在未使用NA的标本中发现了M204I的拉米夫定（LAM）耐药位点变异，比例为1.5%，这用LiPA也检测不到。这个结果说明耐药位点在用药前已存在，如果此类患者使用LAM会更快地出现耐药。
美国斯坦福大学的研究者也用454测序仪对HBV患者的标本进行序列检测。他们选择了11个使用NA治疗的患者（共20个标本）和17例未使用NA治疗的患者（17个标本）。结果显示，UDPS测到了直接PCR测序检测不到的变异，包括LAM耐药变异V173L（5个标本），ETV耐药变异T184L（2个标本）和S202G（1个标本），ADV耐药变异N236Y（1个标本）以及LAM联合ADV的耐药变异V173L、L180M、A181T和M204V（1个标本）。另外，在基因型检测中，将直接PCR测序3个标本判定为G型，而454测序发现这3个标本都混合有少量的A型。在未使用NA的患者标本中，454测序检测到一个标本有M204V的耐药变异，比例为1.3%，一个标本出现A181T变异（1.0%）和M204I变异（1.0%），而PCR直接测序都未发现，也说明耐药位点未用药前已存在。在使用NA的患者标本中，454测序发现10个标本有耐药位点变异，而直接PCR测序只有5个标本检测到耐药变异。
直接PCR测序只能检测>20%的变异，LiPA也只能检测>5%的变异，且只能检测已知的变异位点。由此可见UDPS在耐药检测上具有很大的优势：既可以快速检测高通量的序列，又可以定量检测低频率的变异位点以及一些未知的稀少变异。所以深度测序是目前检测耐药变异最准确的方法。
HCV感染
美国哥伦比亚大学和英国爱丁堡大学等机构的研究人员近日通过高通量测序技术，在家犬中发现了一种新的丙型肝炎病毒。这种新病毒被命名为犬丙肝病毒（Canine Hepacivirus，CHV），能在除人和灵长类动物之外的其他动物上引发类似肝炎的感染。该项研究成果发表在PNAS杂志上。
日本学者最近也尝试用Solexa检测HCV病毒序列的多样性和复杂性，对HCV的遗传异质性进行评估。他们选择了27例丙型肝炎（用PEG-IFN-α+RBV治疗）患者标本测序，共测得约1500千万个核苷酸序列，每个标本超过1000个克隆序列，每个标本的平均覆盖度1705。通过对质粒质控的分析，Solexa测序的CUT-OFF值确定为0.2%。HCV的Solexa测序和PCR直接测序结果比对，总变异的频率为1.04%。采用香农熵Sn代表复杂度，结果显示E2区在所有基因编码区中替换率最高。Sn动力学变化显示，在8个有治疗应答和8个无治疗应答的标本比较中，基线Sn无显著性差异，而PEG-IFN-α+RBV治疗一周后应答组和无应答组的Sn有显著差异，应答组比无应答组的Sn下降更为明显。另外，在丙型肝炎患者标本中，96%都检测到直接抗HCV药物（DAA）的耐药位点，其中70.2%的耐药位点出现比例低于1%。目前虽然还不清楚这些低频的耐药位点会有怎样的临床意义，但至少让我们对DAA药物开发的风险预先有了认识。
在病毒性肝炎研究领域，准种被用于表示感染个体内同种病毒的遗传异质性。准种是病毒基因组遗传变异、种群竞争和药物以及宿主选择的结果，准种特性已经被证实是肝炎病毒具有的一种普遍的生物学特性。准种的存在可使病毒逃脱宿主免疫监控，并可产生对抗病毒性药物的耐药性，给开发有效的疫苗带来困难。传统的准种研究技术只能对准种的部分病毒株进行分析，不可能包括所有的病毒株。与传统的技术相比，新一代测序平台的最大优势是无需繁琐的克隆过程，而是采用Barcode接头进行高通量的并行PCR测序反应，并结合微流体技术，利用高性能的计算机对大规模的测序数据进行拼接和分析，进而定性、定量描述准种的组成和结构。高通量技术的出现，缩短了准种研究的时间，可直接对病毒准种的基因组全长进行研究，从而为病毒在各种选择压力下的进化研究开辟了新途径。
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发表于 2012-3-30 20:10
