隐匿性乙型肝炎病毒感染者血清表面抗体性质鉴定

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【摘要】  目的  了解隐匿性HBV感染者抗-HBs的特性及其与HBsAg的结合能力。 方法  对2例抗-HBs阳性的隐匿性HBV感染者进行长期随访，使用多种试剂盒对患者血清进行多次HBsAg检测，利用不同血清型HBsAg对患者血清进行中和反应，了解血清中抗体亚型情况。PCR扩增S基因构建真核表达质粒，分析S基因变异情况，并将质粒转染HepG2细胞，取培养上清液及转染细胞分别混合进行HBsAg检测。使用患者血清及抗-HBs阳性血清（对照组）对部分HBsAg阳性克隆上清液进行中和反应。不同组间数据比较采用t检验。 结果  多种试剂盒进行的多次检测结果均表明患者血清HBsAg为阴性；HBsAg的3种不同血清型（adr、adw、ay）均能够中和患者血清中大部分抗-HBs（82.1%～100.0%）。S基因序列分析表明核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为95.13%～97.79%和92.04%～95.58%；培养上清液和转染细胞裂解液中HBsAg定量分别为对照组的48.1%和59.3%，上清液/细胞裂解液比值分别为0.85和0.38。中和试验结果显示转染上清液中HBsAg定量较混合前有所降低，但是仍然可以检测到，而对照组检测不到HBsAg，差异均有统计学意义（F值分别为353.6和645.2，P值均<0.01）。 结论  抗-HBs阳性隐匿性HBV感染者体内HBsAg的抗原性及分泌能力有所下降，抗-HBs主要针对不同血清型HBsAg的共同表位，但可能与疫苗注射产生的抗-HBs有所不同。
【关键词】  肝炎病毒，乙型； 肝炎表面抗原，乙型； 肝炎表面抗体，乙型； 隐匿性

Characterization of HBsAbs in occult hepatitis B virus infection    ZHANG Zhen-hua*, ZHAO Xi-ping, XIA Jian-bo, LI Xu, LU Meng-ji, YANG Dong-liang. *Department of Infectious Diseases, the First Affiliated Hospital, Anhui Medical University, Hefei 230022,China
Corresponding author: YANG Dong-liang, Email: [email protected], Division of Clinical Immunology, Tongji Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
【Abstract】    Objective: To investigate the properties of HBsAb in occult hepatitis B virus infection and its affinity to different serotypes of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg). Methods: Long-term follow-up was conducted in 2 HBsAb positive patients with occult hepatitis B virus infection. HBsAg was detected using multiple diagnostic kits and the HBsAb subtype was determined by performing neutralization experiments with different serotypes of HBsAg. The viral S gene was PCR-amplified and mutation analysis was conducted. Plasmids expressing HBsAgs were constructed by inserting these PCR products into an eukaryotic expression vector and were then transfected into HepG2 cells. The cell culture supernatant and cellular extracts were detected for HBsAg respectively. Neutralization experiments were carried out in the cell culture supernatant from HBsAg plasmids transfected HepG2 cells and serum samples from these patients and others who had been confirmed to be positive for HBsAb. Results: Multiple tests using various diagnostic kits showed that the 2 patients were negative for HBsAg and the three different serotypes of HBsAg (adr, adw, ay) could neutralize 82.1%-100% of HBsAb existed in the 2 patients. Sequence analysis of S gene cloned from these patients revealed that the homology to reference strain were 95.13%-97.79% and 92.04%-95.58% respectively at the nucleotide and amino acid levels. Quantitation of HBsAg showed that the expression levels of HBsAg from the two patients were 41.1% and 22.6% respectively of that of control HBsAg in cell culture supernatant and 48.1% and 59.3% respectively in cellular extract, and the supernatant/cell lysate ratios were 0.85 and 0.38 respectively. In neutralization experiments, HBsAg could be totally absorbed by control serum, whereas could only be partially neutralized by HBsAbs from the two patients (F = 353.6 and 645.2, P < 0.01). Conclusion    Both the antigenicity and the ability of HBsAg secreted outside of the cells are decresed in these HBsAb-positive patients with occult HBV infection. The HBsAbs are mainly specific for common epitopes among different serotypes of HBsAg and are probably different as compared with those produced by vaccine inoculation.  
【Key words】Hepatitis B virus; Hepatitis B surface antigens; Hepatitis B surface antibodies;  Occult


目前对隐匿性HBV感染发生机制的研究较多集中在单纯抗-HBc阳性感染上，这主要是因为这类人群比较多，易于得到样本，而且关系到该类人员能否献血等血源安全问题[1-4]。尽管许多研究隐匿性HBV感染的样本也包含HBsAg阴性、抗-HBs阳性的感染者，但往往仅作为总体的部分进行研究，没有对之进行深入的长期随访研究。我们对2例长期随访患者进行深入研究，力图探讨该类患者血清中的抗-HBs性质等。

资料与方法
1. 研究对象：2例HBsAg阴性、抗-HBs阳性慢性HBV感染者均为武汉同济医院感染科患者。病例1：男性，32岁，2003年1月体检时HBV标志物呈HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性，后在不同医院多次复查仍如此，ALT正常。2004年1月体检时发生HBsAg血清学转换，在武汉市荣军医院复查确诊。2005年3月检查，HBV DNA阳性，但HBsAg阴性、抗-HBs阳性，肝功能正常。其后每隔3个月左右进行相关检测，2005年12月来同济医院感染科门诊就诊并进行随访。患者未出现过明显的乏力、纳差、恶心、呕吐、皮肤黄染、尿黄等症状，ALT正常。未曾抗病毒治疗。体格检查无特殊。病例2：男性，62岁，1986年无诱因出现乏力、眼黄、尿黄，查HBV标志物：HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性，ALT异常。后肝功能反复异常，多次住院治疗。1997年HBsAg发生血清学转换，但肝功能仍异常，HBsAg再次转为阳性。1998年给予干扰素α3 MU治疗，1个月后 HBsAg发生血清学转换，3个月后肝功能恢复正常，停用干扰素α。1999-2006年肝功能再次反复异常，多次住院治疗，其中2006年12月在同济医院感染科住院并进行随访，2007年1月再次使用干扰素α进行抗病毒治疗，每次使用护肝等治疗，肝功能能暂时恢复正常。体格检查无特殊。

2. 主要试剂、质粒和菌株：HBV标志物检测试剂盒购自国内外6家公司，其中后继检测采用上海科华生物公司产品，均按照相关说明书进行操作。真核表达载体PXF3H、野生株质粒PXF-W及HepG2细胞由武汉同济医院感染科构建和保存，不同血清型HBsAg由德国Essen大学陆蒙吉教授提供，HS Primerstar DNA聚合酶及内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、XhoⅠ、MluⅠ购自大连宝生物工程有限公司，T4 DNA连接酶购自美国Gibco公司，lipofectimaneTM reagen购自美国Invitrogen公司。Opti-MEM培养基购自美国Life Technologies公司。
3．核表达质粒的构建：按照文献[5-6]设计2对引物进行巢式PCR，外侧引物为FS-S1：5′-GTCAC CATATTCTTGGGAAC-3′（nt2818～2837），FS-AS：5′-CATATCCCATGAAGTTAAGG-3′（nt888～869）；内侧引物为XS1：5′-ACGGAA TTCGAGAACATCGCATCAGG-3′（nt158～174），下划线示酶切位点EcoRⅠ，XS2：5′-GCACT GCAGTTAAATGTAT(A/C)CCCAAAG-3’（nt 835～818），下划线示酶切位点PstⅠ。分别对患者血清进行PCR扩增、纯化、酶切，插入到真核表达载体PXF3H的相应位置，构建真核表达质粒并测序。

4. 细胞转染：以1×105个/孔接种对数生长期的HepG2细胞于24孔培养板中，37℃ 5% CO2孵箱中培养，16h后细胞达到60%～80%融合时进行转染。每种质粒DNA取1.0μg，在1.5ml EP管中用Opti-MEM培养基稀释至总体积50μl。取2.0μl Lipofectamine用Opti-MEM培养基稀释至总体积50μl，室温放置5min。将质粒DNA和脂质体混合，室温放置20min。用磷酸盐缓冲液及无血清和抗生素的DMEM培养基分别洗细胞1次，每孔加入无血清、无抗生素的DMEM培养基0.2ml，将DNA和脂质体混合物分别加入到各孔（复孔，每孔包括质粒0.5μg和Lipofectamine 1.0μl），37℃、5% CO2孵箱中培养。6h后换0.5ml DMEM完全培养基（含10%小牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mmol/L谷氨酰胺）。48h后收集细胞。

5. PXF-S真核质粒的表达和抗原性分析：收集真核表达质粒PXF-S转染HepG2细胞获得的相应细胞上清液（100μl/孔）和转染细胞裂解液进行HBsAg检测，同时将等量各孔转染上清液和转染细胞裂解液分别混合后取100μl，选择野生株转染上清液和转染细胞作为对照组（实验组均为复孔，对照组为4孔），进行HBsAg检测。

6. 抗体型别鉴定：利用不同血清型的HBsAg对血清抗-HBs进行中和后，检测血清抗-HBs含量[7]，具体方法为：对血清进行1∶5稀释后，检测抗-HBs的浓度，再分别加入不同血清亚型（adr、adw、ayw）的HBsAg(5μg/种)，37℃孵育30min，12000r/min离心5min，取上清液检测抗-HBs。

7．转染上清液与患者血清的中和反应：利用HBV标志物均阴性的血清对病例1、病例2及抗-HBs阳性对照血清进行稀释，调整抗体浓度至100 IU/ml，分别挑取患者真核表达克隆转染上清液8孔（抗-HBs检测呈阳性者）、对照上清液（PXF-adw/adr转染上清液）分别与患者血清（100μl/孔）和抗-HBs阳性对照血清进行等比例混和，37℃孵育3h，12000r/min离心5min，取上清液检测HBsAg。

8．统计学方法：采用Prime5.0软件进行序列比对，不同组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结    果
1. 长期随访结果：对病例1进行的随访发现，该患者一直没有明显的不适症状和异常体征，肝功能长期保持正常，HBV血清免疫学指标发生了HBsAg血清学转换，但是HBeAg、HBV DNA长期保持阳性，在知情同意的情况下进行肝组织穿刺，检测HBV DNA、HBsAg和HBcAg均阳性。多次查血常规、尿常规、肾功能、血糖及肝、胆、脾B超，结果均正常。常规风湿免疫学检测正常。病例2临床表现是典型的慢性肝炎，长期肝功能异常，曾经发生HBsAg和抗-HBs的转换，近8年多次检测均提示HBsAg阴性、抗-HBs阳性、HBV DNA阳性，ALT等间断不正常，但患者不愿意进行肝组织穿刺。

2. 真核质粒构建及测序：成功构建了N端含有透明质酸的S融合蛋白真核表达质粒，经PCR鉴定和酶切鉴定，病例1和病例2分别获得了21个克隆（PXF-XS）和24个克隆（PXF-HS）。对构建的S基因真核表达质粒进行序列测定，发现病例1均为B基因型，血清型为adw，但不同克隆的核苷酸序列存在差异，与参照序列（GenBank：D00330）比较，核苷酸的同源性为97.65%～99.12%（表1）。氨基酸序列比较发现1个克隆在56位出现终止密码突变，2个克隆分别在6位和155位发生读码框移（缺失突变），其余克隆氨基酸的同源性为95.13%～97.79%。对突变位点进行分析，发现有较多点突变，尤其是高变区（major hydrophilic region，MHR）存在15个位点的19种变异，如Y100L/C、Q101K、T106A/N、T131N/A、G145R/S和E164G/A等变异。病例2有23个克隆为C基因型（血清型为adr），1个为B基因型（血清型为adw），与参照序列（GenBank：AB033556、D00330）比较，核苷酸的同源性为96.62%～98.38%。氨基酸序列比较发现3个克隆分别在139、172、201位氨基酸出现终止密码突变，其余克隆氨基酸的同源性为92.04%～95.58%（表1）。对突变位点进行分析发现有较多点突变，尤其是MHR区存在较多的突变，有L104S、L110P、T114P、I126T、Q129R、G130N、T131I和G145A等变异。2例患者的克隆均没有发现如P120T和M133L等常见的免疫逃逸突变。

3. PXF-S真核质粒抗原性和分泌能力分析：大多数克隆（病例1：13/21个克隆，病例2：16/24个克隆）的上清液和细胞内HBsAg的A450值明显减少，尤其是上清液中HBsAg的A450值下降更为明显。病例1和病例2混合上清液HBsAg定量分别为对照组的41.1%和22.6%，转染细胞裂解液HBsAg定量分别为对照组的48.1%和59.3%，上清液/细胞裂解液比值分别为0.85和0.38（图1）。

4. 患者血清抗-HBs性质鉴定：利用不同血清型的HBsAg对血清抗-HBs进行中和后，检测血清抗-HBs含量，发现3种不同血清型（adr、adw、ay）的HBsAg均能够中和病例1和病例2血清中大部分抗-HBs（分别为87.3%、100.0%、97.8%和82.4%、82.1%、82.9%），提示抗-HBs可能是主要针对“a”决定簇的表位（图2）。

5. 转染上清液（HBsAg）与血清（抗-HBs）的中和反应：将转染上清液（PXF-XS/HS）与对应血清（病例1/2）或抗-HBs阳性对照血清混和孵育后检测HBsAg，发现在加入相同量的抗-HBs时，实验组HBsAg的量较混合前有所降低，但是仍然可以检测到，而对照组已经检测不到HBsAg，差异均有统计学意义（F值分别为353.6和645.2，P值均<0.01），见图3。
讨    论
一项联合调查结果显示，HBsAg（-）肝炎患者肝组织HBV DNA的阳性率为：意大利11.0%，中国香港6.9%，英国0[8]。Minuk等[9]对美国某社区人群的调查研究结果表明，有既往HBV感染史的人群HBV DNA阳性率达18%；张玲等[5]和Kumar等[10]调查发现，中国和印度HBV感染者家族成员隐匿性HBV感染率可达11.0%和28.8%。关于HBsAg阴性、抗-HBs阳性的慢性HBV感染率，荟萃分析结果显示其可占隐匿性感染的16.9%。
本研究对临床中遇到的2例HBsAg阴性、抗-HBs阳性HBV感染者进行了随访，其中1例长期肝功能正常，亦无不适症状，体检也没有异常，但肝脏病理检测提示肝组织中存在炎症细胞侵润及脂肪变性，无明显纤维化。免疫组织化学显示肝组织存在HBsAg、HBcAg，而且HBsAg呈均质细颗粒状，为胞质型和胞膜型分布，HBcAg的分布呈胞核型和胞质型，与一般HBV感染者HBsAg和HBcAg在细胞中的分布类似。另一例间断出现黄胆、乏力等，说明这种HBV感染可能存在致病性，甚至有导致患者出现肝炎、肝硬化甚至肝癌的可能[11-14]。

2例患者在不同时间、不同医院进行的检测结果均表明患者的确是HBsAg阴性、抗-HBs阳性、HBeAg阳性、HBV DNA阳性的HBV感染者，在随访过程中利用不同的HBV免疫学检测试剂盒（包括Abbott试剂盒）对患者血清进行的检测也进一步证实了这点。病理学和免疫学结果充分证明患者的确存在慢性HBV感染，而且HBsAg阴性、抗-HBs阳性。
目前，隐匿性HBV感染者HBsAg长期保持阴性的发生机制仍不清楚，可能与病毒基因变异、病毒复制和表达水平过低或宿主方面等的因素有关[15-17]。而HBsAg阴性、抗-HBs阳性的HBV感染与其他隐匿性HBV感染的发生机制是否相同或相似也不清楚，机体已经出现HBsAg的血清学转换，体内抗-HBs为何没有产生保护作用？

对S区进行克隆和序列分析表明患者体内的病毒以准种形式存在，克隆间序列差异较大，与野生株相比均有明显差异。将这些真核表达质粒转染HepG2细胞，与野生株相比，大部分克隆的抗原性和分泌能力下降，不同克隆间也存在较大区别，转染上清液和细胞中的平均HBsAg明显下降，说明病毒变异导致HBsAg抗原性发生改变，分泌能力下降。
用不同血清型的HBsAg对患者血清进行的中和反应显示，患者血清中的抗-HBs主要是针对不同血清型S抗原的共同表位，推测可能是“a”决定簇。但当使用过量的抗-HBs对转染上清液中的HBsAg进行中和反应时，患者血清抗-HBs与HBsAg的中和能力明显下降，说明患者抗-HBs和疫苗注射产生的抗-HBs在抗体组成及结合能力等方面有区别。我们的后期研究还发现血清中存在HBsAg和抗-HBs，两者形成免疫复合物，但是HBsAg量较低，抗-HBs量足够大，以至于检测不到HBsAg[7]。
抗-HBs阳性隐匿性HBV感染者体内HBsAg的抗原性及分泌能力有所下降，抗-HBs主要是针对不同血清型的共同表位，但患者体内病毒准种复杂，推测免疫原性有所区别，同时存在针对非共同表位的抗体，导致多克隆抗体可能与普通疫苗注射产生的抗-HBs有所不同，这可能与多种因素有关。


参  考  文  献
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（收稿日期：2010-11-04）
（本文编辑：黄晨）
中华医学会肝脏病杂志版权



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平淡如菊

没太看懂，是不是说HBSAG阴性、HBS抗体阳性也有可能HBV感染，即HBV DNA阳性？原因复杂