乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究进展

tonychant

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究进展
王洁 汪茂荣

【关键词】  肝炎病毒，乙型； 共价闭合环状DNA； 松弛环状DNA
Research advances on hepatitis B virus covalently closed circular DNA  
  WANG Jie, WANG Mao-rong.
【Key words】     Hepatitis B virus;    Covalently closed circular
DNA;    Relaxed circular DNA
【First author抯 address】    PLA Center of Liver Disease, No.81
Hospital of PLA, Nanjing 210002, China
Email: [email protected]

共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA，cccDNA）在HBV的复制及
感染状态的建立过程中起着非常重要的作用，现将cccDNA的研究进展总结如下。
一、HBV cccDNA的检测方法
1. PCR法：PCR法包括普通PCR和定量PCR。由于松弛环状DNA（relaxed circular
DNA，rcDNA）在负链和正链上存在缺口，我们可以设计一对跨越两个缺口的引物
，由于cccDNA有完整的双链，可以被有选择地扩增。但起始模板量不能太高，否
则rcDNA也有可能被扩增，Ko..ck等[1]发现,每个PCR反应管中HBV DNA量在
6×105拷贝/ml时能达到最佳的灵敏度与选择性。
He等[2]最早建立了实时荧光定量PCR，将具有发光基团和淬灭基团的TaqMan探针
设计在负链缺口的下游，与负链互补。在上游引物的引导下，由于cccDNA负链是
完整的，当子链延长到TaqMan探针结合位点时，聚合酶利用其5′→3′的外切酶
活性将探针切断，解除3′端的淬灭基团对5′端的发光基团的抑制作用，产生荧
光信号。由于rcDNA负链不完整，子链无法通过缺口到达探针结合位点，故不会
产生荧光信号，从而将cccDNA与rcDNA区分开。该方法变普通PCR的终点监测为实
时动态检测，不需要对PCR产物开盖检测，减少了PCR产物污染的可能性。
Takkenberg等[3]改良了该方法，以提高其检测的灵敏度和特异性，主要做了两
点改进：（1）PCR扩增条件的改良：50℃ 2 min，95℃ 10min；95℃ 10s，58℃
5s，63℃ 10s，72℃ 20s，55个循环。既保证了复性时引物与模板的充分配对，
又减少了非特异性产物的产生。（2）首次引入非竞争的DNA内参（internal
control DNA，IC-DNA），当IC-DNA的荧光强度为阳性，cccDNA荧光强度为阴性
时，cccDNA才是真正的阴性。设IC-DNA主要是为了监测DNA提取及PCR扩增的有效
性。He等[2]对该方法的检测底线进行了测量，发现10拷贝/PCR时的阳性检出率
为47%，从而推测出15拷贝/PCR的检出率约为50%，与相关报道的检测下限（25～
100拷贝/PCR）比较，改良后的方法有更高的灵敏度，且线性与改良前的方法相
似[4-5]。改良后的方法有更高的特异性，在扩增cccDNA时，不会与HBV rcDNA产
生交叉反应。
2. 入侵检查：针对目标DNA设计两种探针，一种称为初始探针，另一种称为入侵
探针，初始探针的5′端有1段寡核苷酸序列不与目标DNA互补，入侵探针的3′端
的单个碱基不与目标DNA互补，flap核酸内切酶Ⅰ将初始探针5′端不与目标DNA
互补的那段寡核苷酸序列剪切下来，此段寡核苷酸序列与具有发光基团和淬灭基
团的荧光共振能量转移探针结合，从而产生荧光信号。Wong等[6]根据此原理，
设计了与正链上游、负链下游HBV直接重复序列2区结合的入侵探针，由于cccDNA
正链、负链均完整，故产生2种荧光信号，但rc DNA正链含有缺口，故只能产生1
种荧光信号，可根据DNA产生的荧光信号区分cccDNA、rcDNA。
3. 滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）：phi29抗生素DNA聚合酶
具有较好的3′→5′核酸外切酶（校正）活性，能够聚合超过7×104个核苷，而
不与模板分离，从而置换出之前的延长链。更重要的是分枝扩增，因为置换链上
暴露出更多的扩增引物的连接位点。与PCR比较，RCA表现出更少的扩增误差和更
多的扩增产物，更长的产物和更高的保真度。得到全长HBV基因组后，用一步法
PCR进行扩增，基于HBV rcDNA的负链上有一个短的富含A/T的终末端，可用于RCA
产物单位长度HBV基因组的扩增。正向和反向引物设定在终末端中且部分重叠。
两个引物中，LeuI（SapI）的识别位点非常接近重叠部分的序列，LguI从外侧切
断酶切位点，从而在重叠序列中将PCR产物切割下来，释放出全长HBV基因组，并
在没有任何核苷获得或丢失的情况下环化。由于RCA只能有效地扩增完全环化的
DNA模板，虽然HBV rcDNA及其片段有完整的序列，但没有连接成环，故不能够被
扩增[7]。在被HBV感染的细胞中，只有cccDNA能被RCA有效的扩增出来，并且不
会整合HBV序列。RCA可以直接探测cccDNA池水平，对研究HBV基因组变化非常重
要，特别是药物耐受突变的研究。与实时定量PCR比较，这种结合了RCA的PCR方
法可将灵敏度提高10倍。这种联合法可以成功扩增出单用PCR法不能扩增出的乙
型肝炎患者体内的病毒基因组。
4. 染色质免疫沉淀技术（chromatin Immunoprecipitation，ChIP）：通过与
cccDNA特异结合的蛋白质，可以定量cccDNA并进行各种相关研究。ChIP基本原理
是：在生理状态下通过甲醛将细胞内DNA-蛋白质交联在一起，与特异抗体结合的
交联蛋白的免疫共沉淀反应中的DNA，被用作实时PCR的模板。以ChIP为基础的定
量技术，不仅可以研究HBV微小染色体上的细胞蛋白质和病毒蛋白质的体内“招
募”情况，还可研究有HBV复制的细胞中cccDNA功能表观遗传学的调控[8]。ChIP
一般包括细胞固定、染色质断裂、染色质免疫沉淀、交联反应的逆转、DNA的纯
化和鉴定。由于ChIP涉及的步骤多，结果的重复性较低，故ChIP的每一步都应设
计相应的对照，对结果的分析也需要经验。
二、HBV cccDNA检测的临床意义
1. 了解肝炎病毒颗粒的基础特性：Takkenberg等[3]发现部分病毒载量高于
2×106拷贝/ml的患者血清中未检测出cccDNA，可能与引物和探针连接位点的突
变导致cccDNA引物对HBV的连接能力受限有关。通过HBV全基因组的多重比对，发
现HBV基因型对cccDNA的检测和定量的影响十分有限[8]。研究显示，在治疗前后
，C型和B型患者在血清HBV DNA水平、肝内HBV DNA和cccDNA载量、生物化学指标
及组织学指标差异无统计学意义，提示这两种基因型病毒对上述指标及抗病毒治
疗的长期效果没有影响[2]。但由于标本量有限，此观点仍需进一步证实。
Takkenberg等[3]利用改良的实时荧光定量PCR法，证实了血浆中循环的cccDNA依
赖于总HBV DNA水平，并与其成正相关。血浆中cccDNA的来源目前有两种解释：
（1）部分cccDNA并没有到细胞核中重新集合，而是从肝实质细胞中直接释放到
循环当中[6]；（2）cccDNA通过退化的肝实质细胞被释放到循环中。但cccDNA水
平与ALT水平的相关系数相对较低[9]；提示肝细胞损伤并不是血浆中cccDNA的主
要来源。该观点在Takkenberg等[3]的研究中得到进一步证实，重度慢性乙型肝
炎患者的肝损比较严重，但某些慢性重度肝炎患者的血浆却未检测出cccDNA，说
明损伤的肝细胞不是cccDNA的主要来源，也更有力地说明了cccDNA与总HBV DNA
之间的密切关系，即与病毒复制密切相关。
2. 有助于临床合理用药：只有能够彻底清除HBV cccDNA的药物，才是真正“有
效”的抗病毒药物。感染的肝细胞和cccDNA的半衰期都很长，抗病毒药物虽然能
减少rc DNA，但对细胞内cccDNA几乎没有影响[10]。这在美洲旱獭模型中已经得
到了证实，cccDNA的存在也许可以解释慢性乙型肝炎的复发[11]。Margeridon等
[7]通过RCA联合PCR的方法，发现1例血清学已经转为抗-HBs阳性的患者在清除感
染的HBV后，肝脏内仍有残存的cccDNA，证实了在维持基因稳定与再次复发之间
的平衡时，cccDNA池有非常关键的作用，即使血清学已经转为抗-HBs阳性，耐药
突变仍能够发生在cccDNA上，并一直存在下去。对这种迟发的突变，宿主的免疫
应答能力很重要，一旦患者发生免疫妥协，就会面临复发的危险。研究表明，血
清中cccDNA水平是体内HBV再激活的指标，也是肝脏损伤的早期信号[3]。
研究HBV变异，特别是耐药突变的出现以及检测cccDNA池的能力是非常重要的。
rcDNA最初的突变发生在易出错的反转录过程中，并且这些rcDNA补充到cccDNA池
时能够稳定地传播下来。这可能是通过两种途径完成的：（1）含有突变的rcDNA
的核壳体能循环到细胞核中维持cccDNA池；（2）含有突变的rcDNA可能会隐蔽地
感染新的肝细胞，rcDNA又转化成cccDNA。突变的rcDNA基因组在反转录时会与其
他非突变的基因组、新突变的基因组发生竞争。因此，HBV变异的出现，包括药
物耐药的突变，需要较长的过程，可能是几个月甚至是几年[6]。只要定时监测
cccDNA池，就可以预测未来可能发生的问题。肝细胞中cccDNA的检测比检测血浆
中cccDNA更有意义，但要从肝细胞中提取cccDNA，实验要求更高，难度也更大，
需要更加特异、更加灵敏、重复性更好的检测方法。
三、展望
开展HBV cccDNA检测技术研究，深入了解cccDNA分子的结构与体内代谢过程，探
讨cccDNA与病情转归、抗病毒疗效以及清除病毒效果的关系，对于确定抗病毒治
疗的最佳治疗方案、时间和治疗终点等具有重要意义。
参  考  文  献
[1]K鯿k J, Theilmann L, Galle P, et al.Hepatitis B virus nucleic acids
associated with human peripheral blood mononuclear cells do not
originate from replicating virus. Hepatology, 1996, 23: 405-413.
[2]He ML, Wu J, Chen Y, et al. A new and sensitive method for the
quantification of HBV cccDNA by real-time PCR. Biochem Biophys Res
Commun, 2002, 295: 1102-1107.
[3]Takkenberg RB, Zaaijer HL, Molenkamp R, et al. Validation of a
sensitive and specific real-time PCR for detection and quantitation of
hepatitis B virus covalently closed circular DNA in plasma of chronic
hepatitis B patients. J Med Virol, 2009, 81: 988-995.
[4]Chen Y, Sze J, He ML. HBV cccDNA in patients' sera as an indicator
for HBV reactivation and an early signal of liver damage. World J
Gastroenterol, 2004, 10: 82-85.
[5]Laras A, Koskinas J, Dimou E, et al. Intrahepatic levels and
replicative activity of covalently closed circular hepatitis B virus
DNA in chronically infected patients. Hepatology, 2006, 44: 694-702.
[6]Wong DK, Yuen MF, Yuan H, et al. Quantitation of covalently closed
circular hepatitis B virus DNA in chronic hepatitis B patients.
Hepatology, 2004, 40: 727-737.
[7]Margeridon S, Carrou閑-Durantel S, Chemin I, et al. Rolling circle
amplification, a powerful tool for genetic and functional studies of
complete hepatitis B virus genomes from low-level infections and for
directly probing covalently closed circular DNA. Antimicrob Agents
Chemother, 2008, 52: 3068-3073.
[8]Belloni L, Pollicino T, De Nicola F, et al. Nuclear HBx binds the
HBV minichromosome and modifies the epigenetic regulation of cccDNA
function. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106: 19975-19979.
[9]Werle-Lapostolle B, Bowden S, Locarnini S, et al. Persistence of
cccDNA during the natural history of chronic hepatitis B and decline
during adefovir dipivoxil therapy. Gastroenterology, 2004, 126: 1750-
1758.
[10]Michalak TI. Occult persistence and lymphotropism of hepadnaviral
infection: insights from the woodchuck viral hepatitis model. Immunol
Rev, 2000, 174: 98-111.
[11]Hass M, Hannoun C, Kalinina T, et al. Functional analysis of
hepatitis B virus reactivating in hepatitis B surface antigen-negative
individuals. Hepatology, 2005, 42: 93-103.

nwjk

把握当下

tonychant 发表于 2011-9-10 18:17
乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究进展
王洁 汪茂荣

因此，HBV变异的出现，包括药物耐药的突变，需要较长的过程，可能是几个月甚至是几年[6]。只要定时监测 cccDNA池，就可以预测未来可能发生的问题。
---------这是指定期血清检测dna吗？

肝细胞中cccDNA的检测比检测血浆中cccDNA更有意义，但要从肝细胞中提取cccDNA，实验要求更高，难度也更大， 需要更加特异、更加灵敏、重复性更好的检测方法
------这是穿刺吗？还是说现在并没有好办法？

风过西窗

一派胡言，国内的学者就会整一些这样的垃圾论文，连跟随模仿都搞不会，别说什么原始创新了