973拟定项目重要病毒持续性感染形成和维持的分子机

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一、关键科学问题及研究内容

本项目以HBV和HIV为主要研究对象，并在部分环节上以疱疹病毒的成熟研究体系为参照，从靶细胞和机体两个水平探索病毒持续性感染形成和维持的机制。靶细胞水平选择的关键环节包括病毒入侵细胞、病毒复制的调控和病毒拮抗细胞凋亡；机体水平选择的关键环节为病毒诱导的免疫耐受和免疫功能损伤。这些环节基本上是所有持续性感染的病毒在形成和维持持续性感染过程中所必须经历的。通过深入研究，在揭示这些病毒形成和维持持续性感染的特性的同时，争取发现它们之间的共性，为HBV和HIV等病毒持续性感染的防治提供特异性和广谱性的干预靶点。

主要研究内容:

针对上述关键科学问题，拟开展以下研究：

（一）HBV和HIV等与靶细胞相互作用形成和维持持续性感染的机制

1.
HBV和HIV入侵靶细胞的机制：

1)
利用感染细胞模型与原代肝细胞培养体系，研究HBV吸附肝细胞过程中病毒表面蛋白与细胞表面分子相互作用及介导病毒入侵的机制；

2)
利用病毒内吞和膜融合的细胞模型，研究影响HBV和HIV表面蛋白介导的病毒内吞和膜融合的因素，探寻参与病毒内吞过程的细胞分子并研究它们与病毒表面蛋白的相互作用；

3)
利用肠道粘膜活组织模型，探索HIV跨越粘膜屏障及在细胞间传递（感染突触）的机制，研究感染微环境中各种因素（如病毒的存在形式、趋化因子等）对感染过程的影响。

2.
持续性感染中病毒复制的调控机制：

1)
研究HBV表面蛋白调控cccDNA形成的分子机理，研究临床常见HBV准种的表面蛋白在调控cccDNA形成中的功能差异及与临床疾病进展的关系；

2)
研究HIV-1感染靶细胞后，病毒蛋白或基因通过与宿主细胞内元件的相互作用，抑制免疫信号传递的分子机制；

3)
研究HBV影响细胞自噬的分子机理及对病毒复制的影响；

4)
比较HBV和疱疹病毒在调控自噬作用机制上的异同，发现共同的关键节点分子。

3.
持续性感染病毒拮抗细胞凋亡的机制：

1)
研究和确定HBV和疱疹病毒抑制细胞凋亡的主要通路（如死亡受体通路、线粒体通路、内质网通路或细胞周期检验点等）；

2)
鉴定抑制细胞凋亡的病毒因子，分析其抑制机制及相互作用的关键宿主蛋白；

3)
比较不同病毒在持续性感染状态下拮抗细胞凋亡的共性。

（二）HBV和HIV等与免疫系统相互作用形成和维持持续性感染的机制

4.
病毒持续性感染诱导免疫耐受的机制及逆转策略

1)
研究HBV及其病毒成分抑制天然免疫系统（包括肝细胞、树突状细胞及NK细胞等）的识别能力、细胞活化及其免疫网络调节功能等，阐述HBV诱导天然免疫耐受的分子机制；

2)
研究HBV和HIV在微环境中分别在Kuffer细胞和DC细胞的介导下诱导Treg导致获得性免疫耐受的机制。

3)
利用基因敲除、RNAi等技术及调控天然免疫的新型制剂等手段达到抑制病毒复制、切断耐受相关通路、调节Treg等目标，并评估上述手段对免疫功能的影响，探索可能的免疫耐受逆转策略。

5.
病毒持续性感染诱导免疫功能损伤的机制及修复策略：

1）固有免疫细胞功能损伤的分子机制：利用HBV与HIV-1感染者标本，研究APC细胞与NK细胞的表面活化与抑制受体表达、细胞因子分泌、T细胞活化与调节等功能的变化。利用细胞模型与转基因动物模型观察APC免疫功能的损伤及损伤对获得性免疫细胞的影响。

2） T细胞功能损伤的分子机制：利用感染患者，系统观察不同病程来源T免疫细胞的功能损伤情况，包括T细胞功能减少或缺陷、抑制T细胞功能的负向调控与激活调控严重失衡等。

3).
病毒感染免疫功能损伤的修复策略研究。利用细胞模型与转基因动物等模型再现病毒感染引起的免疫功能损伤，并利用基因敲除或RNAi技术，探索利用基因敲除、RNAi或抗体阻断技术，探讨修复损伤的可能机制与修复策略。同时探索抑制免疫系统过度激活降低免疫损伤的策略，观察降低病毒复制、切断抑制通路、提供生长因子等手段对免疫细胞功能与亚群恢复的可能性。

二、预期目标

总体目标：

本项目根据国家重大传染病防治中基础研究的战略需求和国际研究前沿，聚焦于病毒持续性感染形成和维持的关键环节与共性科学问题，选择HBV、HIV为主要研究对象，部分参照疱疹病毒的成熟研究体系，运用前沿组学、分子病毒学、分子免疫学与生物信息学等先进技术，深入研究和揭示病毒形成和维持持续性感染过程中病毒入侵靶细胞、病毒复制的调控、病毒拮抗细胞凋亡及逃避免疫清除等关键环节的分子机制，为研究阻断HBV和HIV等病毒持续性感染的策略，防治相关重大传染病提供科学依据和技术支撑。

通过项目的实施，将培养一批在病毒学研究领域国际创新型拔尖人才和学术骨干，形成具有较强国际竞争力的研究团队，推动我国在病毒持续性感染领域的研究达到国际先进水平。

五年预期目标：

1.
揭示HBV和HIV表面蛋白与细胞分子相互作用所介导的受体特异性与非特异性病毒进入靶细胞的机制。初步阐明HIV跨越粘膜屏障及在首感细胞与终末靶细胞之间传递的机制。

2.
揭示HBVcccDNA形成机制及表面蛋白调控病毒复制的机理及HIV-1感染宿主细胞后如何逃避免疫系统监视而导致持续性感染的分子机制。阐明HBV和疱疹病毒调控细胞自噬以利于病毒复制的分子机制，发现共性的关键分子。

3.
阐明HBV等病毒持续性感染过程中病毒因子与宿主蛋白相互作用，协同调控宿主细胞凋亡的分子机制，发现关键的共性信号通路和分子。

4.
阐明HBV基因组中所含的ODN和病毒蛋白因子诱导固有免疫耐受的机制；揭示HBV和HIV蛋白分别通过枯否氏细胞和DC细胞诱导Treg产生的机制。

5.
揭示HBV和HIV持续性感染中固有免疫系统、T细胞免疫功能损伤的机制；力争获得1-2个具有应用潜力的修复策略，为乙型肝炎与艾滋病的免疫干预与治疗性疫苗的研制奠定理论基础。

6.
培养1-3名在病毒学研究领域具有较高国际声望的创新型拔尖人才，培养20人以上中青年学术骨干，形成具有较强国际竞争力的病毒持续性感染研究团队，争取建立融合分子病毒学、分子免疫学和病毒控制策略研究的国家级科研基地。

7.
发表50-70篇SCI研究论文，其中影响因子10以上的论文2-3篇，影响因子5以上的论文10-15篇，争取在Nature、Science等国际著名综合性学术刊物发表研究成果。

8.
申请5项以上中国发明专利。

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三、研究方案
学术思路：
本项目根据我国重大传染病防控对基础研究的实际需求和国际研究前沿，围绕病毒持续性感染的形成和维持机制这个传染病和免疫学基础研究中的核心科学问题，以HBV（DNA/RNA病毒）与HIV（RNA病毒）为主要研究对象，在部分环节上利用疱疹病毒（DNA病毒）的成熟体系为参照对象，运用前沿组学、分子病毒学、分子免疫学与生物信息学等学科的先进技术，从靶细胞和机体两个层面选择与病毒形成和维持持续性感染密切相关的若干关键环节：病毒入侵细胞、病毒复制的调控、病毒拮抗细胞凋亡以及诱导免疫耐受和免疫功能损伤，通过不同水平的研究模型系统研究病毒与宿主分子的相互作用，对比不同病毒形成和维持持续性感染的机制，力争发现其共性，从而不仅获得对HBV和HIV形成和维持持续性感染机制的新认识，而且为其它病毒持续性感染的研究提供启示，为干预HBV和HIV等的持续性感染提供特异的和共性的靶点。
技术途径：
本项目利用细胞组织模型、动物模型及临床标本，应用基因组学、蛋白质组学、分子生物学、分子免疫学、转基因与基因敲除及RNA干扰等技术，系统研究HBV和HIV持续性感染形成和维持的机制，并在此基础上，利用RNA干扰、抗体阻断等技术探索阻断这些病毒持续性感染的策略。项目的技术路线如下图所示。
项目技术路线示意图
创新性和特色：
本项目以HBV、HIV等持续性感染的形成和维持机制为研究内容，开展系统研究，具有很强的创新性，主要体现在以下几方面。
虽然不同病毒的持续性感染过程各有特点，但它们都必须与同一个人体系统的细胞和分子相互作用，因此，不同病毒的持续性感染过程中不可避免地存在一些共同或相似的性质，发现这些共性对于遏制病毒的持续性感染有极重大的意义。理论上，针对这些共性的防治策略有可能控制多种病毒的持续性感染。研究不同病毒的持续性感染的共性也是国际上传染病学和免疫学研究的最新生长点，所以，本项目在着眼于研究HBV和HIV等持续性感染的特点的同时，注重比较它们之间的异同，以求发现这些病毒持续性感染形成和维持的共性机制。
本项目选择的关键环节包括病毒入侵细胞、复制调控、抗凋亡以及诱导免疫耐受和免疫功能损伤等，是病毒持续性感染形成和维持过程中不可分割的有机组成部分，将这些关键环节纳入同一个项目进行研究，相对于分别就某一个环节进行的研究而言，更有系统性，也更能反映持续性感染形成和维持的整体面貌。
本项目的许多研究内容如HBV入侵细胞的机制、HIV跨越粘膜屏障的机理、病毒通过影响自噬而调控病毒复制、不同病毒抗凋亡机制的比较研究、病毒在持续性感染中诱导免疫耐受或免疫功能损伤机制等都是本领域的重大问题或热点问题。这些重大或热点问题的突破将开辟相关病毒研究领域的新发展方向，可能直接促进新的病毒感染细胞模型和疾病动物模型的产生，从而极大地推动领域发展。而首先在这些问题上取得突破的研究力量显然将在相关领域中取得优势地位，从而使我国在病毒持续性感染研究方面达到国际先进的水平。
本项目拟与国际上本领域的先进实验室（加拿大Alberta大学李嘉诚研究所）通过大型项目的联合资助，探索一条我国与他国间科学研究合作的新途径，实现人员和信息充分交流，资源和技术密切互补，合理分工，加快研究进度，齐心协力攻克科学难题。
可行性分析：
1.        理论上可行：本研究所涉及病毒与宿主细胞和分子的相互作用包括病毒表面蛋白介导病毒入侵细胞、病毒在细胞间的传递、维持持续性感染状态时病毒复制调控与再激活、病毒抵抗宿主细胞凋亡以及通过诱导免疫耐受与免疫损伤逃避或压制宿主免疫系统攻击等研究内容均基于国际相关领域的最新进展以及课题组长期的研究积累，有成功经验可循，部分研究已经取得初步成果。
2.        具有资源优势：项目团队由从事基础研究、临床研究以及动物模型研究的实验室构成，可保障研究工作获得必要的细胞模型、动物模型和临床标本等资源。其中主要承担单位之一复旦大学拥有多种HBV转基因小鼠模型，拥有HIV病毒株与伪病毒毒株近50株。
3.        具有成熟的技术平台：项目团队中的复旦大学与中科院院所已具备国际标准的基因组学、功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学研发平台。项目团队已建立了转基因小鼠与灵长类动物平台，并具备生物安全二级与三级实验室等保障条件，为研究计划的实施奠定了物质基础。各课题组熟练掌握了进行毒力评价研究的多种方法和模型，所需其它各类实验技术均已被研究团队熟练掌握，开展本研究不存在技术障碍。
4.        具有高素质的研究团队：本项目集合了来自多个国家和省部级重点实验室、大多具有海外高水平实验室研究经历的中青年科学家为主体的研究团队，包括国家“千人计划”引进人才1人、中科院“百人计划”引进人才3人、 “国家杰出青年基金”获得者2人、省部级“杰出青年基金获得者”以及地方学科带头人与领军人才多名。集中了乙型肝炎、艾滋病以及疱疹病毒领域的高水平实验室，具有良好的工作基础，为本项目的完成提供了重要保障。
课题设置思路：
本项目紧紧围绕病毒形成和维持持续性感染的机制这个传染病基础研究中的核心科学问题，以我国当前最重要的持续性感染的病毒――HBV（DNA/RNA病毒）与HIV（RNA病毒）为主要研究对象，部分借鉴疱疹病毒（DNA病毒）的成熟研究体系，分两个层面――病毒与靶细胞的相互作用和病毒与机体免疫系统的相互作用开展深入研究。病毒与靶细胞的相互作用选择病毒入侵细胞、病毒维持持续性感染状态时病毒复制的调控与再激活及病毒抵抗宿主细胞凋亡等环节；病毒与人体免疫系统的相互作用选择病毒诱导免疫耐受或免疫功能损伤逃避宿主免疫攻击等环节。因此，本项目共设置了5个课题，分别针对病毒形成和维持持续性感染的五个关键环节。

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课题间的联系及其与项目目标的关系：
本项目的课题设置充分考虑了病毒形成和维持持续性感染所经历的主要关键环节。这些环节是几乎所有持续性感染病毒在形成和维持感染中都需要自然经历的过程，是一个完整的病毒持续性感染过程中不可分割的组成部分，因此各环节之间存在天然的相互联系，分别选择这些环节作为课题研究内容具有鲜明的代表性和合理性，深入研究有助于获得对病毒形成和维持持续性感染机制方面更全面的认识，从而回答本项目的关键科学问题，并为病毒持续性感染的预防控制、疫苗和药物研发等奠定理论基础。
课题1：HBV和HIV入侵靶细胞的机制
主要研究内容：
将围绕上述两种代表性模式病毒在感染细胞的过程中，从病毒吸附到进入的不同时相，将细胞与组织水平模型有机地结合，渐进式地系统研究病毒与宿主细胞的相互作用及其进入靶细胞的方式（受体特异性或非特异性，融合或内吞），并分析影响感染的宿主分子。
1. 研究病毒膜蛋白介导的病毒与宿主细胞作用的分子机制：
(1)        以HepaRG细胞和树鼩原代肝细胞培养体系为细胞模型，利用突变分析技术与生物信息学技术来研究病毒吸附靶细胞过程中病毒表面蛋白分子介导病毒与宿主细胞表面受体分子的相互作用机制。
(2)        利用树鼩原代肝细胞细胞模型来筛选和研究与乙肝病毒表面蛋白相互作用的树鼩肝细胞蛋白，确定它们在乙肝病毒感染中的作用，并结合(1)的研究来验证其相关的人同源蛋白在乙肝病毒感染中的作用。在此研究基础上构建新的乙肝病毒细胞感染模型。
2. 病毒膜蛋白介导的病毒进入宿主细胞的分子机制：
(1)        建立HIV膜融合和细胞内吞的机制的模型：将表达HIV包膜蛋白Env的CD4+细胞与含有HIV受体CD4和辅受体CXCR4的靶细胞混合、模拟HIV膜融合过程;将含有绿色荧光蛋白（EGFP）的HIV假病毒感染CD4-人表皮细胞A431， 检测EGFP评价通过内吞途径进入细胞的HIV病毒量。
(2)        研究分子对HIV膜融合和内吞的影响：利用噬菌体肽库或酵母双杂交技术筛选与HIV包膜蛋白gp120和gp41结合的宿主分子；研究gp120或gp41与这些宿主分子的相互作用，并检测它们对HIV膜融合和内吞的影响，研究HIV进入靶细胞的分子机制。
3. 利用肠道粘膜活组织模型探索病毒在细胞间传递（感染突触）的机制：
(1)        采用近似于生理状态的人肠道粘膜体外活组织感染模型，通过活体成像与双光子技术，在细胞水平验证与病毒粘膜感染相关的宿主细胞分子与病毒的相互作用，观察模式病毒在首感细胞与终末靶细胞之间的传递过程，追踪病毒穿越粘膜的迁徙轨迹。
(2)        分析病毒在穿越细胞膜的过程中，限制病毒入侵靶细胞的宿主因子及其与病毒作用的机制，观察感染微环境中各种因素，如病毒的存在形式、趋化因子的水平及其它各种常态或诱导产生的宿主生物学因素对感染过程的影响。
课题目标：
1)        建立HBV感染的细胞模型并揭示HBV感染肝细胞的分子机制；
2)        阐明HIV通过细胞内吞和融合感染靶细胞的分子机制；
3)        初步确定HIV跨越粘膜屏障并在细胞间传递的机制；
4)        发表SCI研究论文12-15篇，其中IF>10的研究论文1-2篇，IF>5的研究论文4-5篇；
5)        申请1-2项专利；
6)        培养3-5名博士后，10-15名博士研究生。
承担单位:
复旦大学、中科院微生物研究所、中科院武汉病毒研究所
课题负责人：
姜世勃                教授                复旦大学
主要学术骨干：
张晓燕         研究员                复旦大学
张继明                教授                复旦大学
朱以萍                副研究员        中科院微生物研究所
吴春晨                副研究员        中科院武汉病毒研究所

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课题2：持续性感染中病毒复制的调控机制
主要研究内容：
1.        研究HBV cccDNA形成的分子机理及表面蛋白的调控机制
利用诱导表达HBV表面蛋白的细胞模型和突变分析方法，研究HBV cccDNA形成的分子机理及表面蛋白对cccDNA形成的调控作用，发现HBV表面蛋白调控cccDNA形成的主要信号通路，通过过表达、RNA干扰等技术研究参与cccDNA形成的重要细胞因子，着重研究负责细胞内DNA修复的蛋白因子；在以上研究基础上，筛选能抑制cccDNA形成的小分子化合物。
2.        研究HBV准种表面蛋白调控cccDNA的差异及其临床意义
利用生物信息学方法归纳分析临床常见HBV准种的表面蛋白，利用在细胞模型中表达不同的表面蛋白结合突变分析、蛋白相互作用分析等技术手段研究表面蛋白对cccDNA形成的调控及其作用机制及其与临床表型之间的关联性；
3.        研究HIV持续性感染中病毒复制调控机制。
在HIV-1感染靶细胞后，研究病毒蛋白或基因通过与宿主细胞内元件的
相互作用，抑制免疫信号传递的分子机制，包括：1）分析HIV-1主要病毒结构蛋白介导的逃避体液和细胞免疫监视的机理; 2）揭示病毒在基因水平上阻止免疫细胞信号传递的可能方式; 3）研究天然免疫系统在HIV-1持续性感染中的作用。
4.        研究比较HBV和疱疹病毒影响细胞自噬的分子机制
在转录水平（如对自噬关键基因atg5、atg7、atg12等表达的调控）、蛋白质水平（如与Beclin 1，Vps34等自噬关键蛋白因子的相互作用）、钙离子信号通路（如病毒通过钙离子信号通路影响mTOR的活性）等多层次上研究HBV和疱疹病毒影响细胞自噬的分子机制，研究自噬状态的改变对病毒复制的调控，发现自噬信号通路上影响病毒复制的信号分子；在以上研究基础上，筛选能通过影响自噬活性而抑制HBV和疱疹病毒复制的小分子化合物。
课题目标：
1)        揭示HBV cccDNA形成的分子机理，阐明HBV表面蛋白调控cccDNA形成的机制；
2)        揭示HIV-1感染宿主细胞后如何逃避免疫系统监视而导致持续性感染的分子机制
3)        阐明HBV和疱疹病毒调控细胞自噬以利于其复制的机理，发现共同的关键分子；
4)        发表SCI研究论文15-18篇，其中IF>10的研究论文1-2篇，IF>5的研究论文5-6篇；
5)        申请1-2项专利。
6)        培养3-5名博士后，10-15名博士研究生。
承担单位:
复旦大学、上海交通大学、中山大学、中科院上海生命科学研究院、中科院北京生物物理研究所
课题负责人：
谢幼华                教授        复旦大学
主要学术骨干：
赵慕钧                研究员         中科院上海生命科学研究院
张欣欣                教  授         上海交通大学医学院附属瑞金医院
彭华                研究员         中科院北京生物物理研究所
邓强                副研究员 中科院上海生命科学研究院
潘春根    副教授   中山大学

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课题3：持续性感染病毒拮抗细胞凋亡的机制
主要研究内容：
1.        筛选和鉴定乙肝病毒和疱疹病毒抑制细胞凋亡的病毒因子
通过流式细胞技术、TUNEL、Anexin V免疫荧光法比较病毒感染和病毒蛋白及microRNA对细胞凋亡主要通路：死亡受体通路、线粒体通路及内质网通路的影响，从上述研究中发现参与细胞凋亡调控的病毒蛋白及miRNA。
2.        分析病毒因子参与的信号通路
建立表达或可诱导表达病毒蛋白以及病毒miRNA的稳定细胞株，检测细胞中MAP、MAPK、MAPKK、JNK的磷酸化变化、细胞周期检验点关键分子ATM/ATR、Chk1/2、BRCA1、MDM2、p53等蛋白的表达、磷酸化水平及其在细胞内的定位，PI3K/AKT或NIK-NFkB通路中的关键分子变化，明确病毒蛋白以及病毒miRNA参与的信号通路。
3.        研究病毒因子调节细胞凋亡的分子机制
建立病毒蛋白的诱导型表达细胞株，通过串联亲和纯化（TAP）方法寻找与其相互作用的细胞蛋白，分析其直接参与的细胞关键信号通路（细胞凋亡、细胞周期检验点）；通过免疫印迹、荧光素酶报告基因分析等方法分析病毒蛋白是否调控凋亡相关蛋白的转录和翻译；阐明病毒蛋白调节细胞凋亡的分子机制。
课题目标：
1)        揭示HBV和疱疹病毒持续性感染过程中病毒因子（蛋白，非编码RNA）与宿主蛋白相互作用，协同调控宿主细胞凋亡的分子机制，阐明病毒基因产物在建立和维持病毒持续性感染中的作用。
2)        比较不同持续性感染病毒（HBV、疱疹病毒）在调控细胞信号通路的异同点，为控制病毒持续性感染提供理论基础和靶点。
3)        发表SCI论文10-12篇，其中IF>10的研究论文1-2篇，IF>5的研究论文3-4篇；
4)        申请1-2项专利；
5)        培养3-5名博士后，10-15名博士研究生。
承担单位:
中科院微生物研究所、中山大学、中科院武汉病毒研究所
课题负责人：
叶昕                研究员                中科院微生物研究所
主要学术骨干：
罗敏华                研究员                中科院武汉病毒研究所
宋立兵                研究员                中山大学
刘燃义                副研究员        中山大学

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课题4：病毒持续性感染诱导免疫耐受的机制及逆转策略
主要研究内容：
1. 乙肝病毒抑制天然免疫的识别、诱导免疫耐受。
(1)        利用HBV稳定复制的肝细胞系研究HBV Pol蛋白和X蛋白与干扰素生成信号通路中重要分子的相互作用，并进一步在人源肝小鼠HBV感染模型和慢性乙肝患者肝活检组织中进行验证。
(2)        利用HBV复制肝细胞系和人源肝小鼠HBV感染模型研究HBV Pol蛋白和X蛋白对干扰素诱导的JAK-STAT信号的抑制作用及对干扰素效应基因表达的影响。
(3)        利用pDC细胞系、转基因鼠感染模型和慢性乙肝病人队列，研究HBV抑制性ODN序列和HBV分泌的S蛋白作用于pDC干扰素生成相关信号通路的具体环节和作用机制，并进一步研究因pDC功能缺位所引起的天然免疫网络的功能失调。
(4)        HBV诱导NK细胞介导免疫耐受的机制：以健康人、免疫耐受者、免疫应答者为研究对象，分析TGF-β、IL-10对NK细胞抑制性受体NKG2A、活化性分子NKG2D/DAP10、2B4/SH2D1A表达的影响，及与获得性免疫无能的关系。
2.病毒诱导Treg导致获得性免疫耐受的机制。
(1)        HBV诱导CD4+T细胞免疫耐受：以HBV感染鼠为模型，研究肝脏微环境中，HBV通过枯否氏细胞协同作用诱导特异性Treg产生的机制。
(2)        HIV-1感染通过影响DCs TLRs信号通路诱导Treg产生的机制：分析HIV-1感染正常发病者、长期感染不发病者（LTNPs），以及未感染人群外周血或淋巴结中pDCs与mDCs中TLRs信号通路的激活和抑制性因子（IDO等）的表达；分析IDO对CD45RA+CD4+ Naïve T细胞分化为CD25+CD4+ FoxP3+ Tregs的影响。
3.病毒持续性感染免疫耐受逆转策略研究。
建立能模拟HBV慢性感染、具有免疫耐受特征的小动物模型，应用抗病毒药物、针对病毒特异性及可调控天然免疫通路的RNAi分子及能激活天然免疫系统的TLR、RLG等配体和相关小分子，观察抑制病毒复制、切断免疫抑制通路、调节Treg等手段对动物pDC,NK及Treg数量及功能和HBV特异性获得免疫的影响,评价清除HBV感染的效果及成为新型免疫耐受逆转策略的可能性。
课题目标：
1)        揭示HBV诱导固有免疫耐受可能由病毒基因组和蛋白等介导及其分子机制
2)        阐明HBV可通过诱导TGF-β、IL-10产生而抑制NK细胞活化，上调抑制性受体NKG2A，导致NK细胞耐受；
3)        证明HBV和HIV在枯否氏细胞和IDO协同下诱导Treg产生而导致获得性免疫耐受；
4)        建立特异性打破HBV免疫耐受的方案或发现新型策略；
5)        发表SCI研究论文12-15篇，其中IF>10论文1-2篇，IF>5论文4-5篇
6)        申报专利1-2项；
7)        培养3-5名博士研究生。
承担单位:
中国科技大学、中科院上海生命科学研究院、复旦大学
课题负责人：
魏海明                教授                中国科技大学
主要学术骨干：
王建华                研究员                中科院上海生命科学研究院
陈永艳                副教授                中国科技大学
胡芸文                副研究员        复旦大学

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课题5：病毒持续性感染诱导免疫功能损伤的机制与修复策略
主要研究内容：
1.持续性病毒感染致APC损伤的机制及损伤对获得性免疫细胞的影响.
(1)        收集临床HBV与HIV感染者的血标本，利用多色流式与CBA技术，分析APC细胞表面的Toll样受体、CD70、CD80、CD86、MHC等分子的表达，及在病毒、RNA、CpG刺激时炎性分子与调控性细胞因子的分泌，并观察APC对T细胞活化与增殖的影响等。同时对NK受体(NCR1\2\3)、gc类因子受体（IL-12R、IL-15R、IL-18R等）、NKG2A/2C、NKG2D等表面分子的表达进行观察，分析NK细胞因子和趋化或炎性分子分泌功能。
(2)        利用转基因动物等模型观察APC损伤及对获得性免疫细胞功能的影响,临床标本中观察到的损伤现象进一步在动物模型中进行验证，并通过细胞学模型深入探讨其分子机制。
2. 持续性病毒感染致T细胞损伤的分子机制
(1)        持续性病毒感染致T细胞识别障碍与共刺激通路异常. 在不同临床进展阶段的感染者及动物模型，研究TCR通路上T-bet与Eomes的表达是否异常，其他激活活化信号是否异常。同时，在体外培养模型中，利用CD3/CD28、Inomycin/PMA等非特异性刺激，确定感染者T细胞活化信号通路的障碍环节。
(2)        持续性病毒感染致T细胞功能障碍与负向调控失衡机制. 在临床疾病不同阶段的感染者及动物模型，观察T细胞负向调控受体的表达，并在体外培养模型中，利用CD3/CD28或病毒来源的表位肽作为刺激信号，与不同负向调控分子（包括CTLA4、LAG3、CD160、Tim3、BTLA等）的刺激抗体或阻断抗体组合，观察T细胞出现的功能障碍及可能的机制。
3. 病毒感染免疫损失的修复策略研究。
利用细胞模型与动物模型再现病毒感染引起的免疫损失，并利用基因敲除或RNAi技术，探索利用基因敲除、RNAi或抗体阻断技术，探讨修复损伤的可能机制与修复策略。同时探索抑制免疫系统过度激活降低免疫损伤的策略，观察降低病毒复制、切断抑制通路、提供生长因子等手段对免疫细胞功能与亚群恢复的可能性。此外，研究不同T细胞亚群的凋亡机制（如记忆亚群中的Foxo3a），并探索通过阻断凋亡使T细胞亚群恢复长期存活的可能性。
课题目标：
1)        解析病毒持续性感染中固有免疫系统的损伤机制；
2)        揭示病毒持续性感染中抗原特异性T细胞的免疫损伤机制；
3)        争取获得1-2个具有应用潜力的修复策略，为乙型肝炎与艾滋病的免疫干预与治疗性疫苗的研制理论基础；
4)        发表SCI研究论文15-18篇，其中IF>10的研究论文1-2篇，IF>5的研究论文5-7篇；
5)        申请1-2项专利；
6)        培养学科带头人1-2名，培养3-5名博士后，10-15名博士研究生。
承担单位：
复旦大学、解放军302医院、中国医科院基础医学研究所
课题负责人：
袁正宏                教授                复旦大学
学术骨干：
张政                教授                解放军302医院
徐建青                研究员                复旦大学
刘英                副研究员        中国医科院基础所
周晓辉    副研究员   复旦大学

tonychant

四、年度计划
课题一、年度计划内容和目标

        课题一研究内容        课题一预期目标
第

一

年        1.        通过突变分析技术、比较蛋白组学研究技术及生物信息学技术，研究HBV吸附靶细胞过程中病毒表面蛋白分子介导病毒与宿主细胞表面受体分子的相互作用机制；
2.        利用重组杆状病毒表达系统，构建HBV重组杆状病毒；利用HDV系统，产生有HBV包膜蛋白的HDV颗粒，建立HDV感染体系；
3.        利用稳定表达HIV包膜蛋白及靶细胞受体蛋白的细胞，建立并完善HIV膜融合模型，利用绿色荧光蛋白技术在人表皮细胞A431上建立并完善细胞内吞机制模型；
4.        采用人肠道粘膜体外活组织感染模型，进行感染相关的靶细胞及其表面分子分子的特征研究。
5.        收集慢性HBV感染免疫耐受期（高病毒载量）患者和免疫控制期（低病毒载量）患者肝组织标本，用Affymetrix U133 2.0表达谱芯片检测两组患者肝组织的基因表达，分析与HBV载量相关的宿主差异基因。        1.        获得HBV易感细胞、非易感细胞膜蛋白中与病毒表面蛋白和已知辅助受体相互作用的蛋白表达谱差异，以及突变对HBV感染影响的数据，分析得出HBV吸附靶细胞过程中病毒表面蛋白分子介导病毒与宿主细胞表面受体分子的相互作用机制；
2.        获得1-2株具有感染潜力的HBV重组杆状病毒；建立HDV感染体系，作为研究HBV感染机制的重要平台；
3.        建立HIV膜融合和细胞内吞机制模型，对所建模型通过分子生物学、病毒学等多个层面加以验证。以此作为研究HIV感染机制的重要平台；
4.        在细胞水平初步明确与HIV粘膜感染相关的宿主细胞分子特征；
5.        初步筛选出100个与HBV载量相关的宿主差异基因。
6.        发表SCI论文1-2篇。
第

二

年        1.        在树鼩原代肝细胞，以及已建立的HBV易感细胞HepG2-RRP模型上，利用pull down技术筛选HBV表面蛋白preS1的相互作用蛋白，并纯化结合蛋白、质谱分析测序
2.        分析HBV包膜蛋白基因及其序列，结合临床资料构建针对HBV包膜蛋白关键序列或蛋白修饰（如糖基化修饰等）序列的HBV包膜蛋白基因突变体；利用重组杆状病毒系统或HDV感染系统，进行体外肝细胞系或树鼩原代肝细胞的感染分析；
3.        选用大蛋白噬菌体库和骨髓瘤细胞库，筛选与HIV包膜蛋白gp41结合的宿主分子，并通过生物信息学等技术再次筛选得到与HIV感染（通过受体进入途径或内吞途径）相关的蛋白。
4.        采用人肠道粘膜体外活组织感染模型，通过活体成像与双光子技术，观察模式病毒在首感细胞与终末靶细胞之间的传递过程，追踪病毒穿越粘膜的迁徙轨迹；
5.        利用稳定产生HBV的细胞系（如2.2.15）和应用可复制的1.3倍体HBV质粒瞬时转染Huh7细胞，采用RNA干扰的方法，对100个差异基因进行体外验证。        1.        初步筛选到2-5个与preS1相互作用的HBV易感细胞膜蛋白
2.        获得以重组杆状病毒系统或HDV感染系统为基础的体外细胞感染系统;初步获得HBV包膜蛋白上影响病毒感染的关键序列或蛋白修饰作用如糖基化等的数据；
3.        获得2-5个与gp41结合的与HIV进入或内吞途径相关的宿主分子。
4.        了解病毒在首感细胞与终末靶细胞之间的传递过程，初步获得病毒穿越粘膜的迁徙轨迹
5.        筛选出5-10个与控制HBV复制相关的宿主基因。
6.        发表SCI论文2-3篇。
第

三

年        1.        通过分子构建表达、Co-IP等技术确定筛选到的蛋白与preS1之间的相互作用，排除假阳性。并通过生物信息学的方法分析筛选到蛋白在细胞功能中的作用及与HBV的潜在关系；
2.        通过各种蛋白相互作用研究技术确认筛选到的HIV感染相关蛋白与gp41之间的相互作用，排除假阳性。并在已建立的细胞模型基础上，通过HIV感染抑制实验，初步研究该蛋白在病毒感染（通过受体进入途径或内吞途径）过程中的作用；
3.        分析HIV病毒在穿越宿主细胞膜的过程中，限制病毒入侵靶细胞的关键宿主因子
4.        将所筛选出的5-10个基因克隆至真核表达载体，采用过表达等方法，在2.2.15细胞系和瞬时转染细胞系上分析这些基因过表达对HBV复制的影响。


        1.        排除假阳性，确认1-2个有研究潜力的与preS1相互作用的HBV易感细胞膜蛋白或人肝细胞蛋白；
2.        确认1-2个有研究潜力的与gp41相互作用的细胞蛋白，在细胞模型上初步确认该蛋白在病毒感染过程中的重要性；
3.        发现2-3个重要的宿主因子在HIV病毒穿越细胞膜过程中的作用。
4.        确认1-2个有研究潜力的控制HBV复制的宿主基因。
5.        发表SCI论文3-4篇；
6.        申报专利1项。

第

四

年        1.        利用HBV或HBV报告基因载体、RNAi等技术，初步研究筛选到的preS1肝细胞相互作用蛋白在HBV感染中的作用；
2.        利用重组杆状病毒系统或HDV感染系统，建立以小鼠或树鼩等为基础的动物感染模型；以动物感染模型为基础，分析HBV包膜蛋白上影响病毒感染的关键序列或蛋白修饰作用数据，并对体外研究结果进行验证；
3.        通过过量表达及RNAi等技术，进    一步研究gp41宿主结合蛋白在病毒感染（受体进入途径或内吞途径）过程中的作用。同时，选用大蛋白噬菌体库和骨髓瘤细胞库，筛选与HIV包膜蛋白gp120结合的宿主分子，并通过生物信息学等技术再次筛选得到与HIV进入和内吞相关的蛋白；
4.        深入研究前期发现的关键宿主因子影响病毒侵入的机制
5.        采用与4种HBV启动子报告基因共转染等方法，研究这些宿主基因抑制HBV复制的可能机制。利用肝细胞感染模型，研究这些宿主基因及相应的肝细胞蛋白对HBV入侵的限制或促进作用。

        1. 初步测定所获得的肝细胞preS1相互作用蛋白对HBV感染PTH中的重要性，根据结果分析其可能的作用机制；
2. 初步获得一种稳定的动物感染模型；明确HBV包膜蛋白上影响病毒感染的关键序列或蛋白修饰作用数据；
3. 初步阐明HIV通过gp41与一些宿主蛋白相互作用介导的病毒感染的相关机制；获得1-2个有研究潜力的与gp120相互作用的细胞蛋白；
4.初步阐明关键宿主因子对HIV感染靶细胞的作用机制
5. 初步阐明1-2种宿主基因控制HBV复制的新机制。
6. 发表SCI论文4-5篇；
7. 申报专利1-2项。


第

五

年        1.        利用HBV或HBV报告基因载体、RNAi、抗体及preS1小肽等技术，在HepG2-RRP、HepaGR模型以及动物模型上确认筛选到的preS1肝细胞相互作用蛋白在HBV感染中的作用；
2.        通过各种蛋白相互作用研究技术确认筛选到的蛋白与gp120之间的相互作用，排除假阳性。并在已建立的细胞模型基础上，通过HIV感染抑制实验，研究该蛋白在病毒感染（通过受体进入途径或内吞途径）过程中的作用；
3.        观察HIV在感染微环境中各种病毒的存在形式以及趋化因子等对感染过程的影响
4.        在HBV转基因小鼠中验证所筛选到的1-2种宿主基因对HBV复制的调控作用。


        1.        在HepG2-RRP、HepaGR模型或动物模型上，阐明筛选到的preS1肝细胞相互作用蛋白在HBV感染中的作用，分析HBV感染靶细胞的机制；
2.        获得HIV感染靶细胞过程中，与gp120结合的潜在新受体，并初步阐明其作用机制；
3.        了解HIV感染微环境中具有较强感染性的病毒存在形式及其侵入宿主黏膜靶细胞的过程与影响因素，提出可能的生物学干预策略。
4.        阐明1-2种肝细胞内宿主基因控制HBV复制的新机制。
5.        发表SCI论文5-6篇；
6.        申报专利1-2项。

tonychant

年度计划内容和目标
年度        课题二研究内容        课题二预期目标
第
一
年        建立研究cccDNA的细胞模型和小鼠模型；建立HBV感染不同临床转归患者标本数据库的建立；构建表达作用于HIV-1特定基因的siRNA表达系统，CD4+细胞的HIV-1瞬时感染模型和稳定感染细胞株，在HIV-1稳定感染的细胞模型中，利用荧光定量RT-PCR、Microarray等技术测定HIV-1病毒的转录产物；研究细胞自噬对HBV或HBx 转染细胞的生存或死亡的影响；分析HSV-1、KHSV、EBV的vBcl-2结构的异同；建立和完善研究HSV-1、KSHV、EBV的细胞模型，完善染色质免疫沉淀技术的工作条件，筛选、鉴定与各病毒基因组相互作用的病毒/宿主细胞因子。        建立各种细胞研究模型；建立HBV感染不同临床转归患者标本库及临床资料库；初步发现HIV-1病毒感染时的特异性病毒基因转录产物。了解HBV感染或HBx稳定表达对宿主细胞存活率的影响；筛选HSV-1、KHSV、EBV持续感染中可能发挥基础性调控作用的病毒/宿主细胞因子。
发表2篇左右SCI文章。
第
二
年        筛选和鉴定参与cccDNA形成的细胞因子；采用克隆测序或高通量测序技术及生物信息学技术对标本库进行分析，重点分析HBV表面蛋白准种异质性及与HBV感染转归的关系；利用单个病毒基因缺失的HIV-1突变毒株，研究在病毒感染宿主的相关基因的启动子的甲基化程度、组蛋白修饰情况（乙酰化/去乙酰化）、染色质重塑和非编码RNA调控等表观遗传修饰调控的机制；应用CHIP、coIP、EMSA和RIP等方法，开展HIV-1基因复制过程中与宿主细胞成分相互作用的研究；研究HBx、vBcl-2与自噬关键蛋白Beclin 1的相互作用，研究HBx、vBcl-2对Beclin1及其复合物Beclin 1/Bcl-2和Beclin 1/Vps34等的结合活性影响，以及对下游细胞自噬相关蛋白的影响；研究HSV-1、KSHV、EBV再激活过程中相关基因启动子的甲基化程度、组蛋白修饰情况和染色质重塑变化。        发现1-2个参与cccDNA形成的重要细胞因子；初步阐明表面蛋白序列变异特点与HBV持续性感染和转归的关系；完成HIV-1感染过程中有关特定基因的表观遗传学的研究，初步找出可能与某个特定病毒基因相互作用的靶基因或蛋白。证明HBx、vBcl-2通过与自噬关键蛋白质的直接作用来调控自噬的水平；明确HSV-1、KSHV、EBV再激活过程中相关基因启动子的表观遗传修饰调控病毒基因转录的机制。
发表4篇左右SCI文章。
第
三
年        研究参与cccDNA形成的细胞因子的作用机制；研究HBV表面蛋白糖基化变异对病毒复制和逃逸宿主监控的影响；运用gain/loss of function等方法开展HIV-1特定基因对细胞蛋白表达的影响，找出作用途径中的下游分子；研究正常和饥饿条件下HBx、vBcl-2是否通过细胞钙离子的释放，提高钙离子浓度，抑制mTOR活性，增强自噬水平；研究HSV-1、KSHV、EBV再激活过程中，参与染色质修饰调节的宿主蛋白和病毒因子，及其协同作用机制。        初步阐明细胞因子在cccDNA形成中的作用机制；明确HBV表面蛋白糖基化变异对HBV复制的影响；建立HIV-1感染过程中，与病毒基因发生作用的宿主蛋白和基因数据库，找出与病毒基因发生关系的宿主细胞成分的功能。发现并证明HBx、vBcl-2通过钙离子信号通路调控细胞自噬的新机制；初步阐明疱疹病毒再激活过程中不同种病毒组蛋白修饰的异同，为病毒潜伏与激活的表观遗传调控机制提供理论依据。
发表4篇左右SCI文章。
第
四
年        继续研究参与cccDNA形成的细胞因子的作用机制；研究乙肝病毒表面蛋白调控cccDNA形成的分子机制；研究HBV表面蛋白糖基化变异与持续感染形成的关系；应用RNA FISH等方法研究HIV功能性病毒转录子在细胞内的定位，分析细胞成分对病毒结构蛋白在免疫细胞间递呈的影响。分析和评估细胞自噬对HBV和疱疹病毒持续复制的影响，研究抑制自噬是否可以抑制或降低HBV的复制能力，建立自噬检测的高通量筛选系统，筛选有效干扰自噬的活性小分子，用于抑制HBx介导的自噬研究；比较裂解复制、潜伏感染、激活三种情况下病毒在细胞感染模型中转录调控的差异，分析HSV-1、KSHV、EBV再激活过程中，染色质表观遗传调控机制的共性和特性。        进一步阐明细胞因子在cccDNA形成中的作用机制；基本揭示乙肝病毒的表面蛋白调控cccDNA形成的分子机理；阐明表面蛋白糖基化变异与HBV持续性感染发生的关系；初步明确HIV病毒功能性转录子的作用机制，在细胞水平上阐明HIV-1持续性感染的机制。证明细胞自噬对HBV和疱疹病毒复制的重要性，抑制细胞自噬的抑制剂可抑制HBx的活性；阐明疱疹病毒在潜伏感染及激活条件下染色质表观遗传调控机制的共性和特性。
发表4篇左右SCI文章。
申请1项专利。
第
五
年        探索抑制cccDNA形成的途径；研究HBV表面蛋白变异对宿主细胞功能的影响；以临床病人血样为研究对象，分析体液免疫系统和细胞免疫系统中与HIV-1持续性感染有关的信号分子，进一步确定HIV-1持续性感染的机制。从HBx、vBcl-2调控自噬基因表达层面，与自噬蛋白相互作用层面，以及影响钙离子信号通路层面，立体构建HBx、vBcl-2调节自噬的新机制，鉴定抑制自噬的小分子化合物，用于抑制HBV复制的研究；比较并归纳疱疹病毒持续感染中发挥共性作用的基因启动子位点表观遗传修饰调控疱疹病毒基因转录的机制。        初步获得一些能抑制cccDNA形成的抑制分子；阐明HBV表面蛋白变异对宿主细胞功能的影响阐明病毒基因对病毒持续性感染的调控原理；通过对细胞信号通路中的某些关键分子进行干预得以控制HIV病毒潜伏感染的激活，试图中断病毒的持续性感染。确定HBx、vBcl-2对细胞自噬的多层面调控，提供抑制HBV复制的新策略或方法；明确疱疹病毒持续感染中发挥共性作用的表观遗传修饰调控疱疹病毒基因转录的机制。发表4篇左右SCI文章。申请1项专利。


课题三、年度计划内容和目标
年度        课题三研究内容        课题三预期目标
第

一

年        1.        将HBx转染细胞或建立可诱导表达Hbx的稳定细胞系，通过免疫共沉淀和蛋白质质谱分析与其相互作用的宿主蛋白；
2.        以HBV+/－细胞，AEG1, SPHK1和SAM68高表达及敲低的细胞为模型，分析HBV，AEG1, SPHK1和SAM68对NFB转录活性的影响；分析它们是否通过激活IKK/IB信号通路激活NFB活性；
3.        建立细胞凋亡模型，利用该模型筛选能显著抑制细胞凋亡的EBV miRNAs；
4.        用HCMV标准株及其突变体感染神经细胞系，通过比较标准毒株与突变体感染时p53激活的差异，鉴定激活p53的病毒蛋白。        1.        筛选并确认与HBx相互作用的宿主蛋白；
2.        初步阐明AEG1, SPHK1和SAM68对NFB信号通路的调节及其分子机制；
3.        筛选出能抑制细胞凋亡的EBV miRNAs；
4.        初步鉴定能激活p53的HCMV病毒蛋白；
5.        发表SCI论文2-3篇
第

二

年        1.        选择与细胞凋亡信号通路相关的分子进行进一步的分析，通过定点突变、缺失突变等分子生物学手段，验证Hbx与宿主蛋白的相互作用并定位它们的作用位点；
2.        利用IKK和NFB抑制剂处理细胞，分析阻断NFB信号通路是可以抑制HBV拮抗细胞凋亡的作用。
3.        针对抑制细胞凋亡的EBV病毒miRNAs，建立可诱导表达病毒miRNA的稳定细胞株，结合生物信息学手段预测病毒miRNA针对细胞凋亡关键通路的靶标；
4.        过表达相应的HCMV病毒蛋白进行验证其对p53的激活效应；应用表达可调控性突变体，研究特定病毒基因的表达水平与p53的激活效应及其细胞生物学功能关系。        1.        确认与Hbx相互作用的凋亡通路蛋白分子；
2.        确定HBV是否依赖AEG1, SPHK1和SAM68激活NFkB通路和抑制细胞凋亡。
3.        预测EBV病毒miRNAs在宿主细胞中的作用靶标；
4.        验证HCMV病毒蛋白参与调控p53定位及其功能；
5.        发表SCI论文2-3篇。
第

三

年        1.        共转染Hbx或Hbx突变体和其相关宿主蛋白至HepG2细胞，分析病毒蛋白Hbx是否参与调控宿主蛋白介导的凋亡通路；
2.        以HBV+/－细胞为模型，通过检测细胞AKT及GSK3-、FOX3磷酸化水平，研究HBV，AEG1, SPHK1, SAM68是否激活PI3K/AKT信号通路；
3.        利用表达病毒miRNA的稳定细胞株，通过荧光素酶报告基因、定量RT-PCR等分子生物学手段进一步确认miRNA的作用靶标；
4.        分析不同病毒突变体感染时p53在细胞中定位改变、在病毒复制中心与p53共定位的病毒蛋白。        1.        初步揭示Hbx调控凋亡通路的分子机制
2.        基本阐明HBV对PI3K/AKT信号通路的调节及其分子机制；
3.        进一步验证病毒miRNA在细胞中的作用靶标；
4.        阐明病毒特定蛋白对p53蛋白调节作用及作用方式；
5.        发表SCI论文2-3篇
第

四

年        1.        构建Hbx截短突变体，定位Hbx调控凋亡信号通路的功能域；
2.        用PI3K/AKT抑制剂，分析阻断PI3K/AKT信号通路是否抑制HBV对细胞抗凋亡活性的影响；
3.        运用细胞生物学、分子生物学手段进一步分析EBV miRNA如何通过调节靶标基因抑制细胞凋亡；
4.        用HCMV标准株及其突变体感染神经细胞系，经FACS检测并比较细胞凋亡水平的差异，验证病毒蛋白具有抑制细胞凋亡作用。        1.        确认Hbx调控凋亡信号通路的功能域；
2.        阐明HBV是否通过PI3K/AKT通路调控细胞凋亡；
3.        揭示病毒miRNAs抑制细胞凋亡的分子机制；
4.        进一步确认HCMV病毒蛋白调控p53定位及细胞凋亡的功能；
5. 发表SCI论文2-3篇。

第

五

年        1.        收集临床肝癌样品，研究HBV, AEG1, SPHK1, SAM68、Bcl2（或Bcl-xl）表达水平相关性。检测NFB p65在临床肝癌样品细胞核中的阳性率，研究HBV, AEG1, SPHK1, SAM68与NFB信号通路在临床样品中的相关性。
2.        构建miRNAs突变的EBV病毒，比较感染野生型病毒或突变体病毒后B淋巴细胞的凋亡程度；
3.        根据上述结果，选择代表性病毒蛋白深入研究其调控p53的分子机制和信号通路。        1.        阐明临床样本中HBV与AEG1, SPHK1, SAM68及凋亡相关信号通路的关系，揭示HBV在人体内调节细胞凋亡的分子机制。
2.        阐明病毒miRNAs在病毒持续性感染中的抗凋亡作用。
3.        揭示病毒蛋白在HCMV病毒持续感染中抗凋亡的分子机制；
4.        发表SCI论文2-3篇


课题四、年度计划内容和目标
年度        课题四研究内容        课题四预期目标
第

一

年        1、以健康人、免疫耐受者、免疫应答者为研究对象，分析TGF-β、IL-10对NK细胞抑制性受体NKG2A、活化性分子NKG2D/DAP10、2B4/SH2D1A表达的影响，及与获得性免疫无能的关系；
2、收集HIV-1感染正常发病者、长期感染不发病者，以及未感染人群外周血pDCs与mDCs. 签立知情同意书，并获得伦理委员会批准。
3、利用肝细胞系及小鼠模型中观察乙肝病毒及Pol/X蛋白对I型干扰素诱生及信号通路的抑制现象；
5、在慢性乙肝患者PBMCs与纯化的pDCs中检测HBV感染及HBsAg对IFN-α产生的影响。        1、完成各实验体系的建立；
2、证明NK免疫耐受机制；
3、明确HBV及相关病毒蛋白对I型干扰素系统的抑制作用；
4、明确HBV感染及HBsAg对pDCs产生IFN-α的抑制作用；
5、发表SCI研究论文2-3篇。
第

二

年        1、HBV诱导CD4+T细胞免疫耐受：以HBV携带者或HBV感染鼠为模型，研究特异性Treg产生的机制；
2、分析HIV-1对DC功能损伤影响：细胞因子的分泌，刺激Th0分化为Th17/Treg的影响;
3、构建稳定表达Pol或X的细胞系，利用银染联合质谱鉴定与Pol或X相互作用的宿主靶蛋白；确定病毒/靶蛋白相互作用的关键区段；
4、利用pDCs细胞系研究HBsAg胞内亚定位情况；分析其与IFN-α产生受抑制的相关性。        1、证明病毒感染者Treg产生机制；
2、揭示HIV-1感染对DC刺激Th分化与免疫耐受的关系；
3、筛选出HBV-Pol/X影响I型干扰素系统可能的宿主靶点及关键结构域；
4、明确HBsAg抑制IFN-α产生是否依赖于进入pDCs胞内；
5、发表SCI研究论文2-3篇。
第

三

年        1、利用pDC细胞系、转基因鼠感染模型和慢性乙肝病人队列，研究HBV抑制性ODN序列和HBV S蛋白作用于pDC干扰素生成相关信号通路的具体环节和作用机制，并进一步研究因pDC功能缺位所引起的天然免疫网络的功能失调。
2、分析DC调控Th17/Treg分化对HIV-1初始感染的关系;
3、检测乙肝病毒编码蛋白对候选宿主靶蛋白及信号通路相关分子间作用、表达量、细胞亚定位、活性相关修饰等的影响。        1、证明HBV-ODN抑制天然免疫应答机制；
2、揭示DC诱导免疫耐受与HIV-1初始感染的关系；
3、细胞水平揭示HBV Pol/X/HBsAg蛋白抑制肝细胞及pDCsI型干扰素系统的关键环节和分子机制；
4、发表SCI研究论文3-4篇。；
5、申报专利1-2项。
第

四

年        1、研究HBV-CpG打破免疫耐受的机制及可行性方案；
2、从TLR信号通路分析DC调控Th分化的机制；
3、收集慢性乙肝患者血液标本与肝活检组织，验证HBV抑制I型干扰素系统的靶分子及关键环节；
4、利用RNAi技术干扰HBV病毒蛋白及配体刺激干扰素诱生等策略探讨打破乙肝病毒拮抗宿主I型干扰素系统的可能手段。        1、证明HBV-CpG打破乙肝免疫耐受机制；
2、从信号通路分析DC功能调节，揭示HIV-1诱导免疫耐受产生机制；
3、于机体水平验证HBV抑制I型干扰素系统的宿主分子靶点；
4、提出调节宿主免疫及抑制病毒复制的新方案；
5、发表SCI研究论文3-4篇。
第
五
年        1、总体分析HBV和HIV-1感染导致NK细胞、DC、Treg功能变化与诱导免疫耐受、病毒初始感染和致病机理的关系；
2、总结和发表研究结果。        1、从HBV、HIV-1对NK、DC、Treg的调控，揭示病毒免疫耐受机制；
2、发表SCI研究论文2-3篇；
3、申报专利1-2项。


课题五、年度计划内容和目标
年度        课题五研究内容        课题五预期目标
第

一

年        1、利用感染者标本，研究APC细胞与NK细胞的表面活化与抑制受体表达、细胞因子的分泌；
2、利用感染者标本，系统观察不同病程来源T免疫细胞的各种损伤,包括由T细胞受体及其信号通路的缺陷导致的识别障碍、共刺激受体及其信号通路的缺陷导致激活信号放大不足；
        1、完成各实验体系的建立；
2、证明免疫细胞表型与功能损伤的确切存在与特征；
3、发表SCI研究论文2-3篇。
第

二

年        1、利用临床标本，观察APC损伤对T细胞的活化与调节等功能的影响；
2、观察感染者T细胞功能减少或缺陷（最早表现为IL-2与细胞毒性分子的分泌功能缺失）、抑制T细胞功能的负向调控与激活调控严重失衡等；
        1、在临床标本中确认免疫损伤特征；
2、了解不同免疫细胞免疫损伤间的关系；
3、发表SCI研究论文3-4篇。
4、申请专利一项。
第

三

年        1、利用细胞模型与动物模型观察其APC损伤及损伤对获得性免疫细胞的影响；
2、利用细胞模型与动物模型再现观察到的损伤，并利用基因敲除或RNAi技术，探索可能的机制。
        1、在细胞与动物模型中验证免疫损伤存在；
2、揭示不同分子与信号通路对免疫损伤的影响；
3、发表SCI 论文3-4篇；
4、申报专利1-2项。
第

四

年        1、利用基因敲除、RNAi技术或抗体阻断技术，探索可能的机制与修复的策略。
2、在了解损伤机制的基础上，观察消除病毒复制、切断抑制通路、提供生长因子等手段对功能与亚群恢复的影响。
        1、探索APC细胞免疫损伤的修复策略；
2、测试T细胞损伤的修复策略；
3、发表SCI研究论文3-4篇。
第

五

年        1、总体分析HBV和HIV-1持续性感染与免疫细胞损伤间的关系，免疫细胞损伤起始与阻断的关键性因素；
2、总结和发表研究结果。        1、解析HBV、HIV-1对NK、DC、T细胞的损伤机制，获得1－2个修复策略；
2、发表SCI研究论文3-4篇；
3、申报专利1-2项。