乙型肝炎病毒Y（I/V）DD变异模式与基因型关系的分析

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阎丽 肖蕾 魏君锋 孙剑 王战会 侯金林

HBV复制的过程中多聚酶的反转录酶（reverse transcriptase,RT）区自发出现少量的突变，核苷(酸)类似物（nucleostide analogues，NAs）作为药物压力诱导产生特定位点基因型耐药是长期治疗中不可避免的问题。RT区不同位点的变异及补偿变异模式的差异导致HBV复制能力存在很大的差别[1-3]。我们以人类HBV全基因序列为研究对象，分析rtM204位点M→I/V变异及其模式与HBV A～D基因型、与B2和C2亚型的相关性。为NAs治疗方案的优化、耐药管理和最佳干预时机提供变异演变规律相关的信息，以期在临床实践中有效降低、延迟耐药的发生。

资料与方法

1. HBV全基因序列的选择：选择来自基因库、欧洲分子生物学实验室、日本DNA数据库中的2901条人类HBV全基因组序列，剔除不能正确编码YMDD序列或YMDD序列异质性≥2个氨基酸的序列。

2．生物信息学分析方法：用MEGA4软件，以FASTA格式输入HBV全基因序列，根据全基因序列构建系统进化树分型；对变异程度较大的不能明确分型的序列，如前C/C基因变异程度大的序列根据聚合酶RT区/S基因序列系统进化树分型；少数S基因发生基因型重组序列做了前C/C基因序列比较和进化树分析，完成基因型、亚型精准分型。

以YMDD“M”对应的rt204为标志性位点，对齐比较HBV RT区氨基酸序列替代情况。首先调查了11个RT 区公认的耐药变异位点在不同基因型分布情况，其野生型为rtL80、rtI169、rtV173、rtL180、rtA181、rtT184、rtS202、rtM204、rtV207、rtN236、rtM250。单纯rtA181T/V，rtN236T及YSDD、YTDD 变异株不在本研究范围，重点分析Y(I/V)DD变异与HBV主要基因型A～D型的关系以及与B2、C2亚型的关系。并进一步分析Y(I/V)DD 5种主要补偿变异模式（rtM204单点变异、rtM204变异联合1个补偿位点rtL180M或rtL80I/V变异、rtM204变异联合2个补偿位点rtL180M-rtV173L或rtL180M-rtL80I/V变异）的分布特点与A～D基因型、B2和C2亚型的相关性。参照文献报告的RT区42个可能的补偿变异位点的变异情况。关注单独的补偿位点变异情况（单独的补偿位点变异定义：rtM204、rtA181、rtN236为野生型前提下，发生rtL80I/V、rtV173L、rtL180M、rtV207I、rtI169T、rtT184S/A/I/L/G/C/M、rtS202G/C/I、rtM250I/V等8个位点存在的单点变异或组合变异）。

3. 统计学方法：用SPSS13.0统计软件进行数据分析，对计数资料耐药变异检出例数以频数和百分数表示，数据处理用χ2检验或Fisher精确概率法或多个独立样本非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结
果

1. 基因型分布与RT区变异序列：排除不能正确编码的YMDD序列或YMDD序列异质性≥2个氨基酸的序列52株（排除率为1.79%），2849株HBV全基因序列为研究序列，基因型分布为：A型391株（13.7%）、B型542株（19.0%）、C型1138株（39.9%）、D型460株（16.1%）、E型203株（7.1%）、F型65株（2.3%），G型26株（0.9%）、H型24株（0.8%）。rtL80I/V、rtI169T、rtV173L、rtL180M、rtA181T、rtT184S/A/I/L/G/C/M、rtS202C/G/I、rtM204I/V、rtV207I、rtN236T和rtM250I/V 11个位点发生变异的序列总数为287株（10.1%）。分布在A～H基因型。其中A～D基因型占97.9%。为全基因克隆序列。

2. Y(I/V)DD变异特点及其与A～D基因型、B2与C2亚型关系：（1）NAs用药背景：Y(I/V)DD变异毒株共217株，由32个研究小组报告。有拉米夫定（LAM）用药史者122株，均出现病毒学突破，剩余95株序列未提及是否有NAs用药史。两者Y(I/V)DD变异（χ2＝3.23，P＝0.08）差异及主要补偿模式构成（χ2＝4.852，P＝0.30）差异均无统计学意义。(2)Y(I/V)DD在不同基因型及亚型的分布:Y(I/V)DD共217株（15种模式），YIDD 120株（12种模式），其基因型、亚型分布：A型（1株）、B型（B2亚型19株）、C型（C1亚型1株、C2亚型78株和C5亚型1株）、D型（17株）、E型（1株）、G型（1株）；YVDD97株（9种模式），其基因型、亚型分布：A型（17株）、B型（B2亚型22株）、C型（C1亚型3株和C2亚型48株）、D型（3株）、G型（3株）、H型（1株）。Y（I/V）DD在A～D型分布（χ2＝25.558，P<0.01）差异有统计学意义。多组及两两比较结果显示Y（I/V）DD变异在基因型A～C型（χ2＝17.814，P<0.01）及A与B型分布（χ2＝7.198，P<0.01）差异均有统计学意义，Y（I/V）DD变异在基因型B～D型（χ2＝8.430，P<0.05）、C与D型分布（χ2＝8.430，P<0.05）差异均有统计学意义（P<0.05）。Y（I/V）DD变异在基因型B与C型分布（χ2＝2.756，P＝0.097）差异无统计学意义。A型易发生YVDD变异，D基因型易发生YIDD变异。B2亚型发生YVDD变异频数高于C2亚型，C2亚型发生YIDD变异频数高于B2亚型。(3)Y（I/V）DD主要模式比较：Y（I/V）DD 5种主要模式有单纯rtM204I/V、联合1个补偿位点rtL180M或rtL80I/V、联合2个补偿位点rtL180M-rtV173L或rtL180M-rtL80I/V。5种主要变异模式共199株，YIDD 113株（单纯rtM204I模式42株，rtM204I-rtL180M模式23株，rtM204I-rtL80I/V模式38株，rtM204I-rtL180M-rtV173L模式2株，rtM204I-rtL180M-rtL80I/V模式8株），YVDD 86株（单纯rtM204V模式5株，rtM204V-rtL180M模式62株，rtM204V-rtL80I/V模式0株，rtM204V-rtL180M-rtV173L模式16株，rtM204V-rtL180M-rtL80I/V模式3株），rtM204I/V主要变异模式类别构成差异比较，χ2＝96.293，P<0.01，差异有统计学意义。单纯rtM204I、rtM204I-rtL80I/V和rtM204I-rtL180M是rtM204I较多见模式，多位点变异多见于rtM204I-rtL180M-rtL80I。而单纯rtM204V极少见，rtM204V-rtL180M是YVDD优势模式，多位点变异以rtM204V-rtL180M-rtV173L最多见。（4）Y（I/V）DD主要模式在不同基因型（亚型）中分布：Y（I/V）DD 5种主要变异模式共199株，A～D基因型有195株（112/83），B2与C2基因型156株（92/64）。rtM204I A～D 5种主要变异模式在A～D基因型（χ2＝0.832，P＝0.871）、在B～D基因型（χ2＝0.728，P＝0.695）在B2和C2亚型分布差异（χ2＝1.928，P＝0.749）均无统计学意义。rtM204V 5种主要变异模式在A～D基因型（χ2＝16.447，P＝0.00）、在A～C基因型（χ2＝15.827，P＝0.00）分布差异均有统计学意义；在B2与C2亚型（χ2＝9.723，P＝0.02）分布差异有统计学意义。rtM204V-rtL180M模式和rtM204V-rtL180M-rtV173L模式是A～D基因型发生YVDD变异的主要模式，此2种模式在A～D基因型（χ2＝14.009，P＝0.00）分布差异、在B2和C2亚型（χ2＝9.531，P＝0.02）分布差异均有统计学意义。提示B2和C2亚型发生YVDD变异时，B型rtM204V-rtL180M模式占绝对优势，C2亚型比B2亚型更易发生rtM204V-rtL180M-rtV173L变异，rtM204V-rtL180M-rtV173L模式16株均为C2亚型，提示C2亚型具有rtM204V-rtL180M-rtV173L模式高度选择性。C2亚型rtM204I/V变异模式具有多样性和复杂性特征。

3. 伴发rtM204I/V可能的补偿变异位点变异情况：文献[4]汇集了多个研究小组报告的与rtM204位点变异相关的可能的变异位点共42个。逐一计算，rtL229V/W/F的变异（96株）在数量上仅次于rtL180M变异（128株），伴随rtM204I/V共存的rtL229位点变异株有43株，其中30株为C基因型。rtL82M、rtS85A、rtT128I/N、rtL199V、rtA200V、rtS213T、rtS219A等位点变异为少见变异，共44株，C2亚型29株。上述位点变异非基因型特异性氨基酸序列。但已报告的有些位点变异仅仅是某种基因型特异性氨基酸序列。如S256C/G（D型256位点为C）、L217R（A型217位点为R）、N238H（B型238位点为H）、N248S（D、E、F、H 型248位点为S）、V253I（C型253位点为I）。

4. 单独的补偿位点变异序列及基因型分布：14个不同的研究小组报告了34株（1.09%）单独补偿位点变异的序列，其中仅2例使用了LAM，发生的是rtV207I 变异。单点变异30株，组合变异4株。基因型A型（4株）、B型（7株）、C型（18株）和D型（5株）。单点变异rtL80(I/V)14株(9/5)、rtV207I 5株、rtV173L 2株及rtI169T、rtT184L、rtS202G/C、rtM250I等变异株9株。后4者为恩替卡韦（ETV）耐药第3个补偿位点，分布在A2亚型（1株）、B2亚型（4株）、C2亚型（2株）和C6亚型（2株）。2个位点联合变异rtL180M-rtL80I 1株、rtL180M-rtV173L 1株、rtL80V-rtV173L 2株；无rtL80I-rtV173L组合。

讨
论

Zo..llner等[5-6]提出血清亚型adw比ayw易于发生YMDD变异，后续研究发现A基因型易发生YVDD变异，D基因型易发生YIDD变异。Pan等[7]的研究结果显示，中国浙江地区B和C基因型与LAM治疗产生YMDD变异模式具有选择性差异，B基因型易发生YVDD变异，C基因型易发生YIDD变异。由于HBV基因型的分布具有明确的地理区域性，不同地区流行的HBV基因型种类有限，因此，目前有关HBV基因型与YMDD变异的研究也主要局限于各地区有限的几种基因型之间的比较。本研究汇集了不同研究者的结果，涉及的变异序列基于HBV全基因克隆测序，既可以做到基因型、亚型精准分型，又可在全基因水平了解HBV病毒变异的复杂性，对多位点变异是否在同一毒株的判读也是准确的。可提供更多基因型与YMDD变异新的，有益的信息。

本研究结果显示rtM204V/I具有不同的补偿模式。A基因型易发生YVDD变异，D基因型易发生YIDD变异。C2亚型与B2亚型相比，C2亚型发生rtM204I变异频数高于B2亚型，B2亚型发生rtM204V变异频数高于C2亚型，B2亚型主要以rtM204V-rtL180M模式存在，C2亚型具有高度rtM204V-rtL180M-rtV173L变异选择性。通过基因型和rtM204变异推测其后的演变模式，对临床具有一定指导意义。

rtM204I变异模式具有多样性，提示不同的乙型肝炎患者YIDD变异时HBV准种组成的个体差异性很大，C基因型尤为明显。耐药后准种演变具有多样性，挽救治疗中的准种演变个体差异会很大，推测其临床结局可能不同。非C基因型发生YVDD变异时，不同个体乙型肝炎患者体内HBV准种组成简单，rtM204V-rtL180M占绝对优势，推测其在发生耐药后挽救治疗中容易被野生株置换，或者随治疗时间的延长被阿德福韦酯变异株置换，或者容易发生ETV基因型耐药。

C基因型单独的补偿变异模式多于其他型；rtM204I变异模式最多；rtM204V-rtL180M-rtV173L模式具有C2亚型高度的选择性；可能的补偿位点也是在C基因型多见。因此认为C基因型比其他基因型变异情况复杂，尤其是感染C2亚型的患者发生耐药，涉及与耐药相关的变异位点多，组合模式复杂。多位点变异模式如rtM204V-rtL180M-rtV173L复制能力的增强必然会增加后续抗病毒治疗的难度[1]。提示C基因型较其他基因型或亚型HBV感染者在NAs初治失败后，易发生多位点变异而成为难治性乙型肝炎。

本研究结果显示，单独补偿位点变异以rtL80I/V最多，其次为ETV第3个补偿位点变异，这些单独补偿变异及天然rtM204变异株的存在是否会导致NAs天然基因耐药屏障下降有待进一步的研究。这些天然的单独补偿变异也可能会缩短耐药准种转化为优势准种的时间，可能与NAs原发不应答或应答欠佳相关。因此，首次接受NAs治疗，应重视基线病毒RT区潜在变异情况，耐药的检测和管理应从开始用药做起。初治避免耐药变异发生，一旦发生了变异需要尽早开始有效的挽救治疗，抑制变异模式的复杂性演变和阻止多位点变异的发生将有助于获得后续抗病毒疗效。

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