全反式维甲酸和苯乙酸钠联合对人肝癌细胞的诱导分化作用

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       全反式维甲酸和苯乙酸钠联合对人肝癌细胞的诱导分化作用（转载）
         作者简介: 吴 涛（1974-）陕西省户县人.硕士生（导师窦科峰）


　0 引言

　　肿瘤细胞诱导分化是肿瘤治疗研究的新途径，通过诱导可使其分化为正常或接近正常细胞［1］ .分化诱导剂维甲酸毒副作用较大，长期用药易产生耐药性，因此与其他抗肿瘤药物或诱导剂联合作用，增加疗效降低用药量，日益引起人们的重视.我们探讨了全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）和苯乙酸钠（phenylacete natrium，NaPA）联合作用对人肝癌（HCC）细胞的诱导作用，为寻找高效低毒的分化诱导剂及为探讨诱导剂的联合作用效果及其机制提供实验依据.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 ATRA购自Sigma公司，NaPA及RP-MI1640购自Haclone公司，100mL・L-1 小牛血清购自杭州四季清公司，MTT及胰酶购自宝泰克公司，甲胎蛋白放免试剂盒由中国原子能科学院提供.人HCC细胞株SMMC-7721第二军医大学建系本室保存.

　　1.2 方法 人HCC细胞株SMMC-7721细胞接种生长在含有100mL・L-1 灭活小牛血清pH7.0～7.2的RPMI1640培养基中，37℃恒温密闭培养.用2.5g・L-1 胰蛋白酶和0.2g・L-1 EDTA的混合液消化单层细胞，制成细胞悬液，计数后备用.ATRA和NaPA分别溶于无水乙醇中，浓度分别为0.45μmol・L-1 和0.22μmol・L-1 .采用微孔滤过膜双层过滤除菌，避光保存备用.接种细胞预培养12h使悬浮细胞贴壁，然后换以新的培养液，使ATRA和NaPA达到所需的浓度.实验分为:空白对照组，实验组分10μmol・L-1 ATRA处理组，2.5mmol・L-1 NaPA处理组，联合处理组.以上各组均含终体积分数为0.17mL・L-1 的乙醇.对照组及处理组细胞经作用后，胰酶消化，PBS洗涤、离心，30g・L-1 戊二醛固定，于光镜及电镜下观察细胞形态.细胞接种于培养瓶中约108 ・L-1 ，培养24h后换含受试物的培养液，培养1wk.每日取3瓶不同组细胞，用2.5g・L-1 胰蛋白酶消化后，台盼蓝染色，于细胞计数板内计数，绘制细胞生长曲线.细胞以1000个细胞/孔接种量接种于96孔培养板，用各组药物连续处理1wk，以MTT染色法逐日测定.实验终止前4h向细胞液中加入MTT15μL，细胞被染色后，以DMSO100μL溶解染料，于酶标仪上测定吸光度A值（490nm）.细胞以108 ・L-1 接种于25mL培养瓶中，24h后换含受试物的培养液，每日收集实验组和对照组细胞培养液，4000r・min-1 冰冻离心5min，取上清液冻干浓缩后作AFP测定，AFP的测定采用放射免疫测定法，按试剂盒说明书进行，计算1×106 个细胞AFP的分泌量.SMMC-7721细胞经不同实验组处理后，经胰酶消化，700mL・L-1 乙醇固定，加PI50mg・L-1 染色，流式细胞仪分析细胞周期.

　　2 结果

　　2.1 形态学观察 经ATRA和NaPA作用后细胞胞体突触受抑制，细胞大多呈圆形成椭圆形，形态相对规则，对照组细胞则呈多形性.细胞多散在生长，堆集现象减少，培养6d可有胞质空泡出现，细胞逐渐老化.电镜观察显示处理后细胞胞核变得相对规则，呈圆形或卵圆形，核膜平整，未见深切迹，多数细胞仅有一个核仁，染色质变得细而分散.细胞质相对增多，细胞器发达，分泌泡增多.细胞膜较对照组相对规则，微绒毛变化不明显.

　　2.2 细胞生长 SMMC-7721细胞经10μmol・L-1 ATRA，2.5mmol・L-1 NaPA及两者联合作用，3个处理组均出现HCC细胞增殖的明显抑制，且抑制作用随时间延长而增强，ATRA组和NaPA组之间无显著性差异（P>0.05），但两者联合作用比单独作用抑制明显增强（P<0.05，Fig1）.

　　2.3 细胞增殖抑制率 活细胞特别是增殖细胞线粒体内的脱氢酶可将MTT代谢成蓝紫色结晶，并沉积于细胞内，其量与细胞增殖程度呈正比，MTT法 测定反映活细胞量.检测细胞增殖抑制率，联合处理组抑制率明显大于任一组单用，其7d抑制率可达66.5%（Tab1）.

　　图1 略

表1 MTT比色法检测SMMC-7721细胞增殖　略

　　2.4 甲胎蛋白分泌量 不同处理组的作用对SMMC-7721细胞AFP分泌量均呈周期性变化（Fig2）.于3d达到高峰，后逐渐下降，至最低点又开始上升，此与细胞周期存在相关性.同一培养日数，经ATRA，NaPA及联合作用细胞AFP分泌量均明显少于对照组细胞.

　　2.5 细胞周期 流式细胞仪分析结果表明，与相应对照组相比，ATRA处理组可使细胞G0 /G1 增加，S，G2 +M下降（Tab2）.NaPA处理组可使细胞G0 /G1 增加，G2 +M下降，S变化不大.联合处理组对细胞周期各阶段均有明显影响.G0 /G1 是细胞进入分裂期的重要阶段，G0 /G1 增加则进入分裂期的细胞减少.S期是细胞DNA合成期，S期减少则影响DNA合成.由此而抑制细胞增殖，促进细胞分化及凋亡.

　　3 讨论

　　目前诱导分化剂被广泛的应用于肿瘤的研究，在肿瘤的预防和治疗方面已取得一定的进展，其中以维甲酸类药物效果肯定［2，3］ .但诱导剂应用时间过长，剂量过高会带来一系列的毒副作用，并可使患者产生抗药性.因此，联合应用分化诱导剂以及分化诱导剂与其他作用机制不同的化合物联合应用.苯乙酸广泛存在于生物体内，是苯丙胺酸在体内经脱氨基生成的一种代谢产物.对机体无毒性及副作用，苯乙酸钠可与谷氨酰胺结合，降低血浆中谷氨酰胺的水平，选择性诱导细胞生长抑制，影响DNA的合成，从而阻止细胞的生长而诱发凋亡.其诱导方式和作用环节与维甲酸类不同，因此，进行有效的联合用药，可在多个环节上发挥诱导分化作用.ATRA和NaPA联合应用于治疗神经母细胞瘤，NaPA可增加维甲酸受体的表达［4］ .小剂量的ATRA可增强NaPA诱导HL-60细胞分化成熟，使其N-myc水平较单用NaPA或ATRA时进一步下降.

　　图2 略

表2 ATRA/NaPA对SMMC-7721细胞周期的影响　略

　　肿瘤细胞的特点为细胞形态各异，并且增殖速度 非常迅速，细胞分化和细胞增殖是一对矛盾，抑制增殖可促进分化，反之亦然［5，6］ .本结果表明，10μmol・L-1 ATRA，2.5mmol・L-1 NaPA抑制SMMC-7721细胞的增殖和使其处于分裂相的细胞显著降低，而且联合作用效果强于单独作用的效果，各组细胞经台盼蓝染色均未见死亡细胞，在培养过程中，各处理组细胞由形态各异转变为基本上以多角形细胞为主，细胞形态发生了显著变化.ATRA，NaPA及其联合作用均能降低HCC细胞的恶性程度.且随时间增加，细胞增殖抑制率逐渐增大，联合处理组7d抑制率可达66.5%.AFP是胚胎肝、再生肝及HCC细胞分泌的一种癌胚蛋白，各处理组细胞AFP分泌量较对照组显著降低，可能是全反式维甲酸、苯乙酸钠抑制了AFP基因的过量表达.细胞周期分析表明，NaPA处理组细胞G0 /G1 期增大，G2 +M减小，S期无明显变化.ATRA处理组细胞G0 /G1 期增大，S，G2 +M期均减小.联合处理组细胞各周期变化较显著，作用效果强于各自单独作用，其原因可能是两者药物作用于不同的环节，相互促进的结果.

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肝癌细胞能逆转正常吗（转载）
答案是可以的。

癌的“逆转\"，近年来一直是个热门话题。

所谓“逆转\"说的通俗一点，就是把已经形成的癌细胞转化成正常细胞。能够起这种作用的药物，叫做诱导分化剂。诱导分化剂，已经能够在临床上应用的，有一种叫做“全反式维甲酸\",或者简称“维甲酸\"。

维甲酸在治疗肝癌上，究竟有多大意义呢？在实验室中，已经证实，他能够使人的肝癌细胞从形态上到各项指标，都趋向于正常。在临床有怎样呢？近几年，从临床上探索这个问题。结果是令人振奋的。

有的肝癌病人已经手术，把可见的癌细胞切除了，但在血液化验中，甲胎蛋白-这一反映肝癌的指数，仍然相当高。这说明，仍有潜在的肝癌细胞存在。如果不进行治疗，一段时间里这些癌细胞会发展，肝癌会重新表现出来。对一部分患者用维甲酸治疗，结果发现，约有40%的患者的甲胎蛋白可以降低，其中有一些甚至可以恢复正常。表明维甲酸对某些潜在的肝癌细胞，可有治疗价值。另外，有一部分肝癌病人，已经不能进行手术切除，但是还可以用放射治疗,或者介入治疗,也可以有相当的效果。但是,经过这种治疗的患者,也有一些甲胎蛋白不下降,或不恢复正常的。我们也用维甲酸来治疗，发现同上面的试验一样，也有不少患者的甲胎蛋白水平下降了，甚至也有恢复正常的。说明它对经过治疗的残留癌细胞，也有一定的治疗的价值。

至于对晚期肝癌患者，没有发现明显的治疗价值，但对症状有一些改善，病灶稳定，还是有的。

最为一种药物，还需要不断的研究。像所有的药物一样，它还是有一定的副作用。它的应用也有一定范围。因此，患者及其家属，不可盲目用药，不许在医生的指导和首肯下进行

这里，无非介绍一些信息而已。

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听起来确实令人振奋！可到后来还是不理想唉…