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姚鹏
北京军区总医院 肝病研究中心 北京
近年来,越来越多的研究对干细胞进行了探索[1-2],表明干细胞能够分化为多种成熟细胞如神经细胞、心肌细胞及肝细胞。我们知道,肝损伤是广泛威胁着人类健康的一类疾病,目前尚没有令人满意的治疗措施,干细胞应用于肝损伤的治疗具有广阔的应用前景。
一、干细胞研究概况
干细胞(stem cell)是一类具有无限期自我更新能力的细胞。在适当条件和刺激下可以分化为不同类型的细胞[3] 。随着个体的发育和成熟,这些细胞在人体内会逐渐减少。目前认为,干细胞具备以下几点特性:1. 具有自我更新和自我维持能力;2.具有多分化潜能;3.既具有生理性的更新能力也具有对损伤的反应和修复能力。4.干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境。干细胞可以保持静止状态,可以发生自我复制,也可以发生分化。这些行为是由它们邻近的体细胞决定的,后者组成微环境来调节干细胞的生长和分化。在组织受到损伤时,健康细胞产生的干细胞分化抑制因子减少及坏死细胞释放的有丝分裂原能诱导干细胞分化来修复组织损伤。干细胞在适宜的环境和诱导下,可以分化并产生出某个系统,甚至多个系统的各种细胞,并且在体内发育为有功能的器官和组织。因而,使得干细胞在医疗上具有广泛的应用价值。1997-1999年之间,干细胞研究取得了重要突破。Ferrari G等[4] 发现骨髓干细胞具有重塑受损肌肉的功能。之后,意大利国立神经研究所很快又发现成年小鼠的神经细胞干细胞可以被诱导分化为血液干细胞。从而开辟了成年干细胞横向分化研究的新领域。 另一方面 James Thomson等[5]成功地建立了长期在体外培养和复制人胚胎干细胞(Embryonic stem cell)的方法。这两方面的发现引发了在成年干细胞和胚胎干细胞研究领域的一系列新进展,从而使人体干细胞的研究成为生物技术领域的一大热点。
人体系统干细胞之间的转化,对治疗各种疾病具有非同凡响的意义。 Orlic等[6]将骨髓干细胞诱导为心肌细胞并移植成功。为治疗心血管系统疾病提供了有效的手段。Petersen .B.E等[7]发现骨髓干细胞可以转变为肝细胞,从而治疗肝炎和肝功能衰竭; Timothy R. B等[8]将骨髓干细胞转变为脑及骨髓神经细胞,治疗老年痴呆,神经损伤及退行性变等;这使干细胞用于治疗甚至治愈人体各个系统的顽症成为可能。对干细胞分化的进一步认识,为临床应用开拓了一个前所未有的领域。
二、关于肝干细胞
肝干细胞是一种来源于肝脏Herring狭隙和肝内胆管的具有双向分化潜能的细胞,能够分化为肝实质细胞和胆管上皮细胞。这种细胞的细胞质少,具有卵圆形细胞核,故又称卵圆细胞(Oval)。在正常的情况,这种卵园细胞是静止的,数量很少。在肝细胞严重及持续性肝损伤中,肝细胞的增殖能力减弱,这种称为卵园细胞的肝干细胞亚群被激活增殖[9] 。
大量的实验证实了肝干细胞具有分化为肝实质细胞及胆管上皮细胞的潜能。体外实验培养的肝干细胞经诱导可分化为肝实质细胞,植入动物体内肝干细胞也可分化为肝实质细胞及胆管上皮细胞,富含肝干细胞的肝细胞悬液移植动物脾内可获得大量的由干细胞分化而来的肝实质细胞[10-11],并能够提高实验性肝衰竭动物的存活率;肝干细胞在正常情况下处于静止状态,这是因为在多数情况下,肝组织的损伤是通过残存肝细胞的再生来修复的,但在肝再生能力受到毁灭性打击或肝细胞损伤过于严重或因某些因素抑制了残存肝细胞的再生,此时可以观察到Oval细胞的激活、增殖并向肝细胞等分化。此时Oval细胞的增殖与分化可能对肝损伤修复具有极为重要的意义[12] 。
干细胞定向分化是在一些细胞内外因素作用下完成的。细胞-细胞间的作用和一些生长因子促使干细胞向某一专一的方向分化。Catherine等报道[13],丁酸钠对肝干细胞具有促分化作用;二甲基亚砜(DMSO)也具有促进肝干细胞分化的能力,它能够诱导肝干细胞向胆管上皮细胞及肝细胞分化。此外,越来越多的研究表明肝细胞生长因子(HGF)在肝干细胞向成熟肝细胞的分化过程中起着十分重要的作用。HGF能够促进肝干细胞生长增殖,并且促进其向成熟肝细胞分化,HGF已成为肝干细胞分化调控中的重要因子。
肝干细胞及分化产生的肝细胞可以广泛应用于基因治疗、肝细胞移植及生物人工肝等诸多方面[14] 。对于遗传性代谢障碍方面的肝脏疾病,可以利用转基因技术将缺陷基因转入干细胞,筛选出阳性细胞移植入患病肝脏,纠正代谢机能障碍 [15] 。
然而,肝干细胞的研究存在以下问题:(1)来源受限。(2)迄今尚未发现肝干细胞特异性标志物和相应的检测方法。(3)体外培养增殖肝干细胞困难。(4)急性肝功能衰竭、肝坏死等疾病不能等待足够的肝干细胞增殖。因此,将肝干细胞用于各种肝病及肝脏相关性疾病的治疗受到限制。
三、骨髓干细胞是肝细胞分化的重要来源
研究发现,骨髓干细胞是肝细胞的一个重要来源。骨髓内存在大量的成体干细胞,被称为自体损伤细胞修复库。目前很多研究表明骨髓干细胞具有向一些成体细胞分化的潜能,可以分化为包括神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、软骨细胞以及肝实质细胞[16]。在体外诱导剂的作用下,骨髓干细胞可以向肝实质细胞转化。在体内,肝脏微环境诱导骨髓干细胞向肝实质细胞转化也得到研究的证实。
1999年加拿大科学家Petersen B.E.等[17]发现肝干细胞和一些肝细胞可能部分来源于骨髓或与骨髓相关。他们通过以下实验检测了这一思路:1、将一雄性大鼠的骨髓移植到致死量照射的同源雌性大鼠,并用DNA探针检测受鼠肝内有无雄性来源的Y染色体;2、用表达MHC II类抗原L21-6的Lewis大鼠作为受体,不表达L21-6的Brown-Norway大鼠作为供体进行全肝移植,以确定肝外来源的L21-6阳性细胞是否能够定位于移植的肝脏;他们发现,在骨髓移植后13天,在肝内检测到了Y染色体信号,在这一时间卵园细胞开始分化为肝细胞。如果分化为肝细胞的卵园细胞来自肝脏,那么将不会有肝细胞表达阳性的Y染色体信号,但结果显示,一些肝细胞表达明显的Y染色体信号,表明它们来源于骨髓供体细胞。同样,他们在全肝移植后发现,在移植的肝脏内发现有明显的L21-6阳性细胞,这表明一些卵园细胞来源于肝外,而那些来源于肝内的卵园细胞则L21-6阴性。他们的实验表明,骨髓中含有能够分化为肝细胞潜能的干细胞,一些卵园细胞有可能来源于骨髓。
骨髓干细胞可以分化为肝细胞,这种现象是也可发生在人类。2000年 英国科学家 Theise ND等[18] 做了如下实验,2名接受来自男性骨髓移植的女性患者,4名接受来自女性肝脏的男性肝移植患者,取其肝脏标本,通过免疫组化及原位杂交等方法,检测肝细胞内CK8、CK18、CK19的表达及X、Y染色体,发现在接受男性骨髓移植的女性患肝脏标本中检测到了Y染色体阳性信号,接受来自女性肝脏的男性肝移植患者也发现了Y染色体阳性的骨髓来源细胞,来自骨髓的细胞分化成了肝细胞并表达肝细胞的表面标志。实验表明,人类骨髓干细胞确实可以转移定位于肝脏并分化为成熟的肝实质细胞,而部分肝干细胞也来源于骨髓细胞,他们将这种现象称为“转移分化”现象。原则上,这种“转移分化”现象应在肝损伤时发生,而这种“转移分化”现象与肝损伤的程度之间的关系尚难估价。分化发生的刺激可能是多方面的,包括细胞因子、内环境的改变、肝损伤等。
日本科学家也发现在新鲜的骨髓细胞中检测到表达甲胎蛋白(AFP )mRNA的肝前细胞,推测表达AFP的肝前细胞能够被旁分泌的HGF诱导分化。骨髓干细胞通常出现在骨髓中,能够分化为多种细胞,包括骨、肌肉、脂肪、心肌细胞等。上述研究表明骨髓干细胞同样可能分化成为肝实质细胞。骨髓中的肝前细胞可以用于肝衰竭的移植治疗而不必考虑组织相容性抗原(MHC)的配型问题,因为患者自身的骨髓细胞就可以用于移植[19]。骨髓细胞具有以下优点:1).可以制备富含干细胞的骨髓细胞;2).通过转导促进基因能够增加骨髓来源的肝细胞;3).可用骨髓来源肝细胞用于生物人工肝;此外HGF也可以通过促进包括骨髓干细胞的肝前细胞分化用于肝硬化治疗。干细胞移植治疗血液病,肌肉损伤修复,神经系统疾病及心血管疾病已应用于临床,并取得了良好效果。自体骨髓干细胞移植治疗肝损伤将为肝脏疾病的治疗提供新的途径。
四. 干细胞移植与肝脏疾病
干细胞分化为具有功能的组织细胞并应用于器官损伤的治疗,是人们关注的热点及追求的目标。干细胞移植是将干细胞植入体内,分化为有功能的实质细胞,以替代因退变、损伤、基因缺陷或自身免疫而受损的细胞,重构组织器官的结构和功能,是器官移植的发展和改进。经过大量的研究,细胞移植已具有较为完备的实验及理论基础,在治疗器官衰竭和多种遗传代谢性疾病方面蕴涵着巨大的潜能。介入放射学的飞速发展也为细胞经导管体内移植提供了条件。因此,在理论与技术方面均为干细胞肝脏移植提供了保障。
肝脏微环境对骨髓干细胞诱导分化起重要作用。骨髓干细胞可以在体内横向分化为肝细胞,这种转化需要肝再生微环境的存在。研究表明,通过骨髓基质细胞和肝细胞的混合培养,既可以促进成熟肝细胞体外增殖,同时又可以促进骨髓基质细胞向肝细胞的分化,这表明肝实质细胞与骨髓干细胞是互相作用的[20]。虽然经过骨髓移植的方法,细胞可以从外周血管进入体内,但是在全身循环后可能只有少量进入肝脏定向分化。经过介入的选择性血管内细胞移植技术,可以将骨髓干细胞直接注入肝脏。成体干细胞参与组织损伤的修复可能存在两种方式:1组织内固有的干细胞参与修复;2组织损伤动员骨髓时释放造血干细胞,后者通过血液循环到达该组织,在特定的环境下增殖、分化,最终转化成为该组织细胞,以完成结构与功能重建,而后者在某些条件下有可能起主导作用。由于克隆技术以及应用人类胚胎的研究受到限制,而骨髓干细胞可直接来源于成人的骨髓或外周血,采集方便,不存在伦理上的争议,作为专能干细胞的生物学特性及优势,使其有可能成为干细胞移植的理想选择。
我们曾对150 例肝病患者进行了自体骨髓干细胞移植的研究,初步临床应用结果显示,多数患者接受自体骨髓干细胞移植治疗后临床症状评分比治疗前有所改善;观察干细胞移植后肝功能的变化结果显示,患者在移植后,谷丙转氨酶(ALT),总胆红素(TBIL)逐渐降低,血清白蛋白(ALB)在干细胞移植治疗后逐渐升高,提示肝功能改善。对上消化道出血、肝性脑病、腹腔感染等常见并发症及原发性肝癌的发生情况的观察研究发现,干细胞移植后消化道出血、肝性脑病、腹腔感染及原发性肝癌的发生率与对照组比较无显著差异。提示自体骨髓干细胞移植治疗尚不能明显改变肝病患者并发症的发生率。
此外,观察自体骨髓干细胞移植后患者生存及预后情况。发现在移植24周内,死亡和肝脏移植患者比例与未移植组相近,提示自体骨髓干细胞移植目前尚不能有效改善患者的预后。自体骨髓干细胞移植后除少数有轻度恶心,发热,兴奋失眠及局部疼痛外,未见其他严重不良反应。 然而,由于该项目开展的时间较短,病例数有限,对于其疗效和副作用的准确评估还需要进一步观察。
肝功能严重衰竭,目前还没有特效的治疗措施,尽管肝移植为肝衰竭患者提供了有效的治疗方法,但是由于其费用高昂,供体肝源有限,从而使肝移植的广泛应用受到了限制。干细胞移植目前尚不能替代肝脏移植,但将为肝病患者提供一条新的治疗途径,此外自体骨髓干细胞移植不存在免疫排斥反应,创伤小,价格低廉,具有良好的应用前景 |
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