大部分肝切除后肝细胞生长因子和增殖细胞核抗原作用的研究

药罐

同济医科大学学报2000年第29卷第4期



大部分肝切除后肝细胞生长因子和增殖细胞核抗原作用的研究



唐望先　王俊平　杜荔菁　张文英　杨镇



　　摘  要：为了探讨肝切除后肝细胞生长因子（HGF）及增 殖细胞核抗原（PCNA）在肝再生中的作用，制备大鼠肝切除后肝再生模型，应用免疫印迹法 及免疫组织化学染色分别检测HGF的分子形式及PCNA的表达。结果发现：HGF在肝切除后残存 的肝组织中的含量在12 h显著增加，是正常的14倍。增加的水平维持到24 h。但HGF的重链 带低于检测水平。PCNA在肝切除后残存的肝组织中的表达明显升高，于术后24 h达高峰。阳 性细胞高达54%。提示HGF在肝再生中的作用是微不足道的，而PCNA可以作为一种肝细胞增生 的指标。



　　关键词：肝细胞生长因子；肝切除术；增殖细胞核抗原；免疫组织化学



　　肝细胞再生的研究是目前生物医学领域中的一个重要课题。而肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor ，HGF）在肝切除中是否起重要作用有待进一步研究，本实验采用免疫印迹 分析法测定肝切除后不同时间HGF的分子形式，并采用免疫组织化学ABC法，通过对部分肝切 除后不同时间的冰冻新鲜肝组织的增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ）表达来观察肝细胞再生的情况。



1　材料与方法



1.1　试剂

　　6-氮基-2-萘-对胍苯基二甲基磺酸盐（NM）购自Toril公司，苯甲基磺酰氟（PMSF）和 乙醇胺丙基二甲氨基丙磺酸盐（CHAPS）购自Sigma公司。Sp-Sepharose购自LKB生物技术中 心，HGF单克隆抗体由日本三菱公司提供。增殖细胞核抗原试剂盒由北京邦定生物医学公司 提供。

1.2　实验动物、分组及手术

　　本研究所有实验采用Wistar大鼠(同济医科大学实验动物学部提供)，体重在220～250 g，随 机分成2大组，即手术组和假手术组，各组包括正常、3、6、12及24 h。实验组按Higgins和 Anderson方法改良行肝大部分切除术。3%戊巴比妥钠麻醉（30 mg/Kg）后，上腹正中切口， 切除肝脏的中叶和左叶，关上腹腔。假手术组仅切开腹壁，然后关上腹腔。分别于手术后3 、6、12及24 h再次麻醉，下腔静脉抽血，取残存肝组织作相应的测定。

1.3　HGF分子形式的测定

1.3.1　大鼠组织中HGF粗提物的制备：根据Miyazawa所介绍的方法稍加改良。不同时间肝组织进行匀浆。每份标本加有4倍量含有Tris-HCl缓冲液(0.15mol/LNaCl,10mol/LEDTA，100mol/LNM,1mmol/LPMSF)。然后在4℃条件下，15000r/min中离心20min，上清4℃条件下，再次30000r/min中离心60min，80～150mg蛋白悬液用含有1ml/LChaps，0.15mol/LNaCl以及100μmol/LTris-HCl平衡。用0.15mol/LNaCl3ml以及0.4mol/LNaCl缓冲液8ml洗柱，用0.65mol/LNaCl缓冲液3ml提取HGF，提取液用浓缩器浓缩。最后的提取液补充4倍量pH6.8的含有0.1%ChapsTris-HCl。

1.3.2　免疫印迹分析：采用Laemmli法分析样品，经过7.5%的SDS-PAGE电泳后，蛋白质转印到聚偏二氟乙烯膜上。膜与单克隆抗体共孵育2h，然后再与辣根过氧化物酶标记的抗体孵育2h，随后加ECL检测试剂。在X光片上爆光，结果用密度检测仪检测。

1.4　PCNA的检测

　　PCNA的免疫组织化学ABC法实验步骤：①取新鲜肝组织作冰冻切片，切片置于预先用poly-L-lysine处理过的载玻片上，丙酮固定10min。电吹风吹干备用；②3g/LH2O2封闭内源性过氧化物酶，室温，30min；③PBS（0.01mol/LpH7.4）振洗2min×3；④加入鼠抗PCNA单抗（1∶50），湿盒中，37℃孵育2h。⑤PBS振洗2min×3；⑥加生物素羊抗鼠抗体，湿盒中，37℃60min；⑦加预先混合的ABC复合物，湿盒中，37℃20min；⑧加入临时配制的DAB显色液，显微镜下观察显色；⑨苏木素复染后，80、90、95ml/L酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。

　　实验结果判定：PCNA阳性染色呈棕黄色颗粒，主要分布在肝细胞核内。在显微镜下随机观察10个视野/只大鼠，100个细胞/个视野。按下列公式计算PCNA的指数：

PCNA指数=染色阳性细胞数×100%全部肝细胞数



2　结果



2.1　手术后不同时间的残存肝组织中HGF的分子形式

　　与正常组相比，假手术组HGF的含量增加约两倍，但肝切除12h后，HGF的含量显著增加，是正常的14倍，含量增加维持到24h。但HGF的重链带低于检测水平，无水解活性。给予CCl4后的肝组织中的HGF作为阳性对照，可检测到有水解活性，见图1。







图1　肝大部分切除后不同时间残存肝组织的HGF形式的变化

N=正常　S=假手术　PH=肝大部分切除　CCl4=阳性对照



2.2　手术后不同时间的残存肝组织的PCNA免疫组织化学 染色



　　在术前大鼠肝组织内见少量的PCNA染色，但肝切除后12h肝组织内PCNA染色明显增多，24h达高峰。PCNA指数结果见图2。







图2　肝大部分切除后不同时间残存肝组织的PCNA指数的变化



3　讨论



　　HGF对体外上皮细胞具有广泛的生物学作用。在胚胎期和成熟期的许多组织均有HGF基因及其 受体的表达。但是，体内HGF的生理学作用仍然未完全了解。以往的研究表明，在正常的情 况下HGF在组织中以无活性的形式存在。无活性的HGF必须经蛋白水解后才能发挥其生物活性 。因此，阐明此种蛋白水解激活系统对了解HGF的生理作用具有重要意义。Miyazawa等证实 了一种来自人血清的新型丝氨酸蛋白酶，后者使单链形式的HGF激活。他们把这种蛋白酶视 为HGF的激活剂。因此，HGF的激活需要首先诱导出激活剂活性。HGF的激活剂首先是作为一种无活性的酶原而产生的，这种酶原通过蛋白水解剪切而激活。凝血酶可能有这种激活作用。由CCl4所致肝损伤级联反应可能导致HGF的激活。而激活后的凝血 酶再将酶原形式的HGF激活剂转换成有活性的形式。与HGF激活有关的丝氨酸蛋白酶活性仅仅 存 在于损伤的肝脏中。肝再生时，激活的HGF对肝细胞可能发挥一种丝裂原性生理作用。本研 究为了探讨HGF在部分肝切除后的肝再生中的作用，检测了手术后不同时间肝组织中HGF 的分子形式及含量。结果表明：虽然HGF的含量在术后12 h显著增加，是正常的14倍，但活 性形式HGF的重链带低于检测的水平。因此，HGF在组织切除后的肝再生反应中的作用是微不 足道的。

　　另有研究表明，在部分肝切除后的肝再生和单侧肾切除后残存的代偿性肥大中，HGF受体下 调。不过本研究表明，HGF在肝组织中仍然是以无活性的形式存在。因此，HGF下调不是HGF 结合的结果。由于一种生长因子受体的下调可以是另外一种生长因子作用的结果，因此，HG F的下调可能受到了除HGF之外的一种或多种生长因子的调节（与肝再生有关者）。

　　增殖细胞核抗原是DNA多聚酶的辅助蛋白，其合成与DNA的复制和细胞的增殖有着直接的关系 。因此，肝脏PCNA的表达可以反映出肝细胞内DNA的合成及肝细胞增生的活性。我们通过对P CNA的免疫组化检测来观察肝细胞再生的情况。结果发现，在手术后12 h即有PCNA表达的升 高，于术后24 h达到高峰。提示PCNA可以作为一种肝细胞增生的指标。

　　肝细胞再生过程是错综复杂的，它包括再生启动和再生停止两个方面，这两个方面的完成依赖于肝组织（包括肝细胞、肝间质及细胞外基质）及某些肝外组织来源的因子和营养物质的相互作用。参与调节的激素亦是众多的，其中EGF、胰岛素和胰高糖素对培养肝细胞起直接的调控作用，但其作用的机制还有待进一步研究。



国家教委回国人员基金资助项目 ［教外司留（No. 1995-135）］

唐望先，女，1953年生，主任技师

唐望先（同济医科大学附属同济医院　肝病研究所）　

王俊平（同济医科大学附属同济医院　肝病研究所）　

杜荔菁（同济医科大学附属同济医院　肝病研究所）　

张文英（同济医科大学附属同济医院　肝病研究所）

杨镇（外科,武汉　430030）



参考文献



1，Miyazawa K, Shimomura T, Naka D et al. Proteolytic activation of hepatocyte growth ractor in response to tissue injury. J Biol, Chem, 1994,269:8 966

2，Okajima A, Miyazawa K, Kitamura N. Primary structure of rat hepatocy te growth factor and induction of its mRNA during liver regeneration following h epatic injury. Eur J Biol Chem, 1990,193:375

3，Tashiro K, Hagiya M Nishizaqa T et al. Deduced primary structure of rat hepatocyte growth factor and expression of the mRNA in the tissue.Proc N atl Acad Sci USA, 1990,87:3200

4，Sonnenberg E, Meye D, Weidne K M et al.Scatterfactor/hepatocyte grow th factor and its receptor, the c-met tyrosine kinase, can mediate a signal exc hange between mesenchyme and epithelia during mouse development. J Cell Biol, 19 93,123:223

5，Miyazawa K, Shimomura T, Kitamura A et al. Molecular cloning an d sequence analysis of the cDNA for a human serine protease responsible for acti vation of hepatocyte growth factor. J Biol. Chem, 1993,268:10024

6，Tajima H, Higuchi O, Mizuno K et al. Tissue distribution of hepa tocyte growth factor and its exclusive down-regulation in a regenerating organ after injury. J Biochem, 1992,111:401

7，Chijiiwa K, Nakano K, Kameoka N et al. Proliferating cell nuclea r antigen, Plasma fibronectin and liver regeneration rate after seventy percent hepatectomy in normal and cirrhotic rats. Surgery, 1994,116:544

8，Bucher N L R. Liver regeneration: A overview. J Gastroenterol Hepato logy, 1991,6: 615