乙肝患者的好消息

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Good news for Hep B patients[br]乙肝患者的好消息[br][br][br]New Zealand Herald 27.07.05[br]新西兰号角 2005年7月27日[br] [br][br][br][br]Scientists have created a powerful new treatment for hepatitis using a revolutionary technique that switches off harmful genes, providing hope for the two billion infected worldwide with the B strain of the virus.[br][br]科学家们发明了一种治疗乙肝感染非常有力的新方法, 他们利用一种可以关掉有害基因革命性的技术给全球20亿乙肝感染人带来希望. [br][br]The scientists have found that a few regular injections of the new drug can result in a 90 per cent reduction in the amount of virus circulating in the bloodstream of infected animals.[br][br]科学家们发现, 几轮正常新药的注射, 病毒量在被感染的动物血液循环中减少几乎90%. [br][br]The replication of the hepatitis B virus is blocked by the phenomenon of RNA interference, which switches off the genes it needs for survival.[br][br]乙肝病毒的复制程序被RNA干扰现象阻止, 从而关掉了病毒生存需要的基因. [br][br]Results of a study have shown that RNA interference can work so[br]effectively against invading viruses such as hepatitis that scientists believe the technique can be developed to produce an entirely new class of antiviral drugs.[br][br]研究的结果显示RNA干扰工作对于入侵的病毒, 比如乙肝病毒, 非常有效, 科学家们认为这个新技术可用来未来整体抗病毒药物的发展和生产.[br][br]RNA interference has been described as one of the most exciting[br]developments in medical science and the latest study has shown it is able to stop the spread of hepatitis B virus in infected laboratory mice.[br][br]RNA干扰被形容为医学科学最激动人心的发展之一. 最新的研究显示它可以让乙肝病毒感染的老鼠停止传染. [br][br]The results of the study, published in the journal Nature Biotechnology, are so encouraging that the scientists are planning to begin the first human trials of RNA interference on hepatitis B patients at the end of next year.[br][br]被刊登在这期的[自然生物科技杂志]上的研究结果非常鼓舞人心, 科学家们可能会在明年的年终第一次开始人的RNA干扰临床试药.[br][br]Some two billion people have been infected with the hepatitis B virus and more than 350 million have chronic or lifelong infections that often kill by causing liver cirrhosis and cancer.[br][br]大约全球有20亿人感染有乙肝病毒, 大约有三亿五千万人为终身慢性感染, 造成因为肝硬化和肝癌死亡. [br][br]Although there are vaccines to protect against infection, the drugs to treat hepatitis B are relatively ineffective as well as being prohibitively expensive for most of the people in the developing world who are chronically infected.

虽然目前有疫苗保护感染, 但是治疗乙肝的药物都不是很有效益, 且很多发展中国家慢性感染的患者不能支付价格昂贵的药物被阻挡在门外.[br][br]The latest study by David Morrissey and colleagues at the biotechnology company Sirna Therapeutics in Boulder, Colorado, used a form of RNA interference that switches off key genes of the hepatitis virus that it needs[br]to replicate.[br][br]美国科罗拉多州Boulder的Sirna治疗公司的David Morrissey 医生(很象尤太人的名字, 如果我们有猜错)和同事所做的最新研究中, 他们用了一种RNA干扰因子关掉了乙肝病毒复制需要的基因. [br][br]Dr Morrissey wrapped short molecules of RNA that were specifically targeted against the hepatitis B virus in a fatty globule that was able to carry or "deliver" the drug into infected cells of the liver.

Morrissey医生将可以抗拒乙肝的RNA干扰短分子用脂肪小球包裹, 因为这样可以容易被”输送”到被感染的肝细胞中. [br][br][br]A few daily injections were followed by a single injection given once a week, which reduced the amount of hepatitis B virus in the bloodstream by 90 per cent, with the effect lasting six weeks.[br][br]每周一个单独注射之后几个每天的注射可以将血液中的乙肝病毒减低90%, 并且可以持续6个星期. [br][br]RNA interference was first described in 1998 and since then it has caused a stir inside the medical community because of its potential to deal with a range of illness, from cancer and viruses to inherited disorders such as Huntington's disease.[br][br]RNA干扰是1998年提出的, 之后在医疗界引发了很大的震动, 因为它和很多疾病有牵连, 比如, 汉停顿舞蹈症 (Huntington's disease). [br][br] Sirna Therapeutics has already begun a trial of RNA interference on patients suffering from age-related macular degeneration, which causes visual impairment in many thousands of people over 50.[br][br]Sirna治疗公司已经开始了老年黄斑病(一种视网膜退化的疾病)RNA干扰临床试药, 因为这个疾病让很多年过50岁的人们失去视力. [br][br]About a quarter of people over the age of 65 are affected by the disorder.[br][br]大约有1/4年龄超过65岁的老人患有这种疾病. [br][br] Sirna has developed a form of RNA interference designed to switch off or silence a key gene that is thought to stimulate the growth of blood vessels at the back of the eye which leads to macular degeneration.[br][br]Sirna发明了一种可以关掉一个基因或让基因钥匙不灵光的RNA干扰, 这个基因被认为是促进眼球背后血管生长造成失明.[br][br]

[此贴子已经被作者于2005-8-8 2:30:21编辑过]

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[医疗新讯] siRNA的新认识

微小但是强有力的siRAN(small interfering RNA)分子继续给科研人们带来兴奋的信息和希望.最新发现显示,这个微小的siRNA分子可以引发人体内自然干扰素对细胞的作用的生成. 长远看, 这个微小的分子可能是未来对于艾滋病毒/艾滋病, 肝炎和其它很多病毒感染. 直到不久前,siRNA对于科学来说还是陌生的. 这个小小的遗传信息是细胞DNA产生的, 但是它们和其它RNA不一样的是不去进行蛋白的组合, siRNA的作用和工作都在DNA上,将基因开开, 关掉, 剪断一段基因信息, 留下其它, 也就是它们管理细胞的形成发展和作用功能. 2002年siRNA曾被[自然],[发现]等杂志命名为年度科学最佳突破"(Breaakthrough of the Year), 对医学治疗和研究上具有深远潜力和希望. 今年, 美国肿瘤协会的Rossi医生和伙伴发现, 发表在Nature Biotechnology期刊上, siRNA可以直接激发某个细胞产生抗病毒的自然蛋白--干扰素. 特别是是位置在siRNA末端一个的化学分分子"tri-phosphate" 是制造干扰素开关的钥匙. 这个发现建议, 细胞可能具有对于含有"tri-phosphate"RNA作为复制信息的病毒天赋/固有的免疫答应. 研究还发现,细胞制造的干扰素还具有杀死感染生病细胞的效应. 这个也给癌症研究带来了曙光. 让我进一步了解如何或为什么我们人体细胞能够识别人体的RNA和病毒的RNA, 病毒复制生存的途径等. siRNA比我们以前想象的---仅仅是传递制造蛋白用的要复杂宽阔的多. 这将是科学家下一个研究的议程. 蝴蝶妈妈所去的肿瘤医院在全国/全球协助siRNA在人体内研究很有贡献, 前几个月曾经曾有史以来第一次用基因工程方法将含有抗HIV(艾滋病病毒)的siRNAs植入人体干细胞血(脐带血). 这样会产生含有HIV抗拒效益的免疫T细胞和吞噬细胞, 从而试图达到治疗艾滋病的最基础和重要效益. siRNA在肝炎, 比如乙肝的治疗上也有研究和进展:目前可以在培养基中利用siRNA阻碍HBV的复制等, 这里有个文章不错: Inhibition of HBV replication by siRNA in a stable HBV-producing cell line -------------------------------------------------------------------------------- HEPATOLOGY October 2003 . Volume 38 . Number 4 Original Articles: Viral Hepatitis Inhibition of HBV replication by siRNA in a stable HBV-producing cell line Masayoshi Konishi ,Catherine H. Wu ,George Y. Wu Abstract Potent inhibition of endogenous gene expression by RNA interference has been achieved by using sequence-specific posttranscriptional gene silencing through the action of small interfering RNA molecules (siRNA). In these reports, the natural function of genes could be deduced through the ensuing loss of function. Based on the extraordinary effectiveness in silencing endogenous genes, we wondered whether siRNA could be applied against viral replication in a hepatitis B virus (HBV) model using HBV-specific siRNA. To test this idea, HepG2 2.2.15, a human hepatoblastoma cell line that constitutively produces infectious HBV particles, was transfected with HBV-specific siRNAs and controls. HBV surface antigen (HBsAg) secretion into culture media was inhibited by 78%, 67%, and 42% with siRNA against the polyadenylation (PA), precore (PreC), and surface (S) regions, respectively, compared with controls as detected by enzyme-linked immunosorbent assay. After exposure to HBVPA siRNA, Northern blot analysis showed that HBV pregenomic RNA levels were decreased by 72%, and levels of HBV RNA containing the polyadenylation signal sequence were suppressed by 86%, as detected by RNase protection assay. Levels of HBV core-associated DNA, a replication intermediate, also decreased by 71%. Immunocytochemistry revealed that 30% to 40% of the cells transfected with HBVPA siRNA were completely negative for detectable HBsAg levels. Controls consisting of treatment with HBV-specific siRNA alone, lipofection reagent alone, or random double-stranded RNA (dsRNA) lipofection complex failed to decrease HBV surface antigen, HBV messenger RNA (mRNA), or core-associated HBV-DNA levels. In conclusion, siRNA inhibits hepatitis B viral replication in a cell culture system. Future studies are needed to explore the specific delivery of siRNA to liver cells in vivo and the applicability of this approach. (HEPATOLOGY 2003;38:842-850.) Publishing and Reprint Information From the Department of Medicine, Division of Gastroenterology-Hepatology, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT. Received April 3, 2003. Accepted July 19, 2003. Supported by National Institutes of Health grant DK-42182 (G.Y.W.), the Herman Lopata Chair in Hepatitis Research (G.Y.W.), and an ALF Blowitz-Ridgeway Foundation seed grant (C.H.W.). Address reprint requests t George Y. Wu, M.D., Ph.D., Department of Medicine, Division of Gastroenterology-Hepatology, University of Connecticut Health Center, 263 Farmington Ave., Farmington, CT 06030-1845. E-mail: [email protected] ; fax: 860-679-3159. Copyright © 2003 by the American Association for the Study of Liver Diseases. 0270-9139/03/3804-0009$30.00/0 doi:10.1053/jhep.2003.50416

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以下文章由MAYMAY提供:

RNAi

在美丽隐杆线虫中发现RNA干扰现象之后，很快发现在许多类型的病原微生物中都存在同样的RNA干扰现象. 如果蝇、锥虫、涡虫、线虫，以及高等的哺乳动物细胞，甚至是人的细胞中也都发现类似的RNA干扰现象. 对其作用机制进行研究，发现是一些22-25 nt大小dsRNA产生抑制或降解靶RNA分子的作用，统称为小干扰RNA(small interference RNA， siRNA)，根据其发挥RNA干扰现象的dsRNA的具体长度又可以分成2类: 24-25 nt的长siRNA和21-23 nt的短siRNA. 这两种类型的siRNA都可以通过与靶mRNA分子进行序列特异性的结合、抑制与降解，阻断或破坏靶基因的表达. 另外一种可能作用的机制就是dsRNA诱导同源基因的甲基化，从而使目的基因表达关闭. 另外，小分子的dsRNA同时也是很强的干扰素诱导酶如PKR、RNase L的激活剂，可以产生类似干扰素的抗病毒效应. RNA干扰策略在抗肝炎病毒治疗中首先在HCV的研究中获得了成功. McCaffrey et al设计合成了针对HCV NS5B基因区的dsRNA，当与NS5B表达载体进行共转染时，在鼠肝细胞中观察到dsRNA对于NS5B基因的表达水平抑制率达到75 %，如果dsRNA与NS5B的表达载体进行共转染，抑制率可以达到98 %. 说明siRNA策略在抗HCV基因治疗中的应用前景. 多年来由于缺乏合适的HCV感染/转染细胞模型，因此对于抑制HCV的研究进展缓慢. 近年来关于HCV复制子(replicon)的建立，使得在细胞系水平上研究siRNA的效果成为可能. Randall et al就利用HCV的复制子细胞模型对于dsRNA抑制HCV RNA复制的效果进行了研究. 在Huh-7细胞系中，dsRNA对于HCV RNA的复制水平具有显著的抑制作用，而且是剂量依赖性的. 对于dsRNA作用的序列依赖性的特点进行研究，2株HCV变异株仅有3 nt的序列差别，只有dsRNA与作用的靶HCV RNA序列完全同源时才具有抑制作用，因此，dsRNA对于靶基因的表达抑制具有严格的序列特异性的特点. dsRNA对于HCV RNA抑制的作用效果是指数性的，在4 d之内，就可以降低HCV RNA的复制水平达80倍. 导入siRNA之后，可以使98 %以上的有HCV RNA复制的细胞不再有HCV RNA的复制，这些细胞中再也检测不到HCV的抗原表达和HCV RNA的复制. 这些研究结果表明，基于siRNA的抗HCV 治疗是十分有希望的. 有7个研究小组分别研究了以乙型肝炎病毒（HBV）表面（S）基因、核心（C）基因、前C基因和X基因为靶位的siRNA作用，抑制效率达42%～78%，鼠模型在体研究中以S基因和C基因为靶位的siRNA可使HBV表面抗原和e抗原降低至1/3。特别是S基因区的siRNA持续抑制达11d，而C基因区siRNA的抑制效率仅持续3～5d。 在抑制HBV复制研究中最有意义的结果是：RNAi除了有效抑制活跃复制的HBV，还能抑制非活跃复制的HBV，这一点不同于核苷类似物，因此，有可能发展成为与拉米夫定、阿德福韦等核苷类似物作用机制和位点不同的抗HBV药物联合用药。RNAi不能达到对病毒复制的完全抑制，限制了其作为单剂用药的可能性，因此，今后抗肝炎病毒的作用可能定位在与其它药物的联合用药与辅助用药中。但是，与其抗肝炎病毒治疗的应用并不矛盾，因为，抗生素在细菌感染中的应用经验表明，对不同靶点的药物联合作用将显著提高抗微生物的效果。同时，RNAi本身可以通过对多靶位的联合作用进一步提高抑制效率。RNAi发挥作用依赖于与靶序列完全同源，也需要多靶位RNAi联合应用，避免单个RNAi在病毒变异时失去作用。 但是，由于对siRNA的认识时间尚短，因此目前还没有具体的siRNA抑制乙型肝炎病毒的研究结果，但是从目前关于HCV的部分研究结果来看，从其他类型的病毒的抑制效果来看，siRNA还是具有希望的抗肝炎病毒治疗的新策略. 当然，由于肝炎病毒RNA分子在体内的二级结构特点，针对不同基因区段的siRNA的抑制作用效果也肯定有所差别，因此针对HBV、HCV基因序列的特点，还需要进行优化，寻找最为有效的抑制靶点. 作为一种新型的抗肝炎病毒的可能的策略，siRNA也具有其相当明显的局限性. 例如HBV和HCV基因序列高度变异，存在明显的基因准种(quasispecies)群，而siRNA对于靶RNA分子的识别，又是以碱基配对方式进行的，因此要想全面控制HBV、HCV的复制，我们就需要无数种序列不同的siRNA分子，显然是很难做到的. 因此，我们还必须针对这一特点进行深入细致的研究，克服这一困难，使siRNA抑制靶基因的表达策略更能切合临床抗肝炎病毒治疗的需要.

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MAYMAY提供:

RNAi研究进展

看到了一篇相关的资料，转过来。 摘要 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制. RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制. 目前已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究，有可能为肿瘤基因治疗提供新策略. 引言 RNAi (RNA interference )即RNA干扰，是1998年由Fire首次发现并命名的转录后水平的基因静默，是美国《Science》和《Nature》评出的2002年度最重要的科技成果之一，正成为基因功能研究和基因治疗研究的热点. 1995年，康奈尔大学的Guo和Kemphues et al [1]利用反义RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断秀丽新小杆线虫(C. elegans)中的par-1基因的表达以期得到与对照组注射正义RNA(sense RNA)相反的结果，但最终的结果却令他们费解:二者同样阻断了par-1基因的表达途径. 直到1998年，Fire et al [2]的研究证明，在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA. 这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的. 这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi). 随后的研究发现，RNAi现象在多种生物中存在，如线虫，果蝇，斑马鱼，真菌以及植物等. 生物体可利用RNAi来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用[3]. 到1999年Tuschl et al [4]报道在哺乳动物中也存在RNAi，只是导入的RNA是小干扰RNA (siRNA); 2001年Berstein et al提出: 只有22核苷酸(nt，nucleotide)才能特异性地阻断dsRNA，同时他们还发现了体内一个分解dsRNA为siRNA的叫Dicer的酶[5]. 近几年来RNAi的研究取得了很大进展，他被《Science》杂志评为2001年的十大科学成就之一. 2002年RNAi的研究又有了新的突破，发现他在基因表达调控中发挥重要作用，他也名列2002年《Science》杂志评的十大科学成就之首. 1 RNAi的机制 RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成-22 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶(multicomponent nuclease，RISC)并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达. RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员. Dicer酶广泛存在于蠕虫、真菌、物及哺乳动物体内. 他的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点. 在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21-23个核苷酸的siRNA，他启动了细胞内的RNAi反应[5]. 因少量双链RNA即能阻断基因表达，且此效应可传至子代细胞，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统. 研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRP). 在RdRP 的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增. 双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成小片段siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA. 小片段siRNA生成后与核酸酶形成复合物，随后mRNA与小片段的正义链置换，被mRNA替代. mRNA的位置与最初正义链的位置相同，从而被核酸酶在相同的位点降解. 更有意义的是mRNA的降解使核酸酶得以再生，这样周而复始，mRNA得以降解，因此RNAi呈酶解动态[6]. 由于mRNA也以21-23 nt的特定间隔降解，因此认为降解dsRNA与mRNA的核酸酶相同. 另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链. 结果mRNA也变成了双链RNA，他在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA. 这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制[4-5]. RNAi不同于其他基因阻断技术，他是转录后水平的基因静默机制，因此注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应. RNAi具有较高的特异性，能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，且抑制基因表达效率很高，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果. dsRNA小片段如小于21-23 nt (如10-15 nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21-23 nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围. RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代[6]. 2 RNAi在细胞中的研究和双链RNA的构建 2.1 Billy et al [7]的研究表明: 在小鼠的胚胎细胞中也存在RNAi . 将727个碱基对的双链RNA转入小鼠的畸胎瘤细胞，诱发了细胞内的RNAi机制，并抑制了报告基因的表达. 但大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细胞后，会非特异的阻断基因的表达. 因为长的双链RNA进入哺乳动物成体细胞后，细胞内的病毒防御机制被激活; 且RNA酶L(RNase L)被激活，产生非特异的mRNA降解. 而未分化的胚胎细胞中，上述防御病毒的机制存在缺陷，因而双链RNA能特异的阻断基因的表达. 但Tuschl et al [8]人的研究克服了这一障碍，他们发现，21个核苷酸的双链RNA能够诱发哺乳动物细胞内的RNAi机制，同时不会激活细胞内的干扰素. 他们合成了以荧光素酶的mRNA为靶分子的21个核苷酸的双链RNA，将他和荧光素酶的表达质粒用脂质体共转染到NIH3T3，COS-7，Hela S3，293细胞中，报告基因的表达被抑制了90%. 由于报告基因得到的结果不能完全说明细胞内的情况，他们又合成了细胞内源性基因laminA/C为靶目标的双链RNA，这个双链RNA也特异的抑制了laminA/C的表达，抑制率达到90%以上. 2.2 双链RNA的构建 双链RNA可先在体外构建好，用脂质体转染细胞. 但有些细胞脂质体转化效果差，转化到细胞内的双链RNA半衰期短. 而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转到细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用. 构建双链RNA表达载体，使用RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成. 因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，他指导的转录就会终止，且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，因此合成的RNA无polyA尾. U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别，合成出RNA. Sui et al [9]用Bluescript作为载体，RNA多聚酶Ⅲ可识别的U6作为启动子，从绿色荧光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断(片断1)，将其插入到Bluescript载体中. 然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2. 他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA. 片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止. 而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3’端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，因而有利于双链RNA诱发RNAi. RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1-RNA 启动子. 在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA[10]. T7也可作为启动子合成dsRNA. 将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体. 用此载体可先在体外合成dsRNA，或将其转入到细胞内合成dsRNA. 在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶[11]. 腺病毒是体内转基因的常用载体. Xia et al [12]用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA，并成功的阻断了基因的表达.

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上接上文:

3 RNAi的应用

3.1 高通量研究基因功能 基因功能研究现在已经明确，双链RNAi干扰(RNAi)技术不仅可抑制体外细胞中特定基因的表达，而且也可抑制体内特定基因的表达. 在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定其功能. 21nt siRNA的双链复合物在哺乳动物细胞中干扰成功为基因作用的研究提供了一种新的工具，原来要花费 6mo-1 a才能明确一个哺乳动物细胞基因如何关闭，现在只需一个星期就能明确10个基因的关闭，使工作进程大大加快. 可以预见，RNAi作为一种快速静默基因的途径，将会越来越多地用于哺乳动物基因研究. 将功能未知的基因的编码区(外显子)或启动子区，以反向重复的方式由同一启动子控制表达. 这样在转基因个体内转录出的RNA可形成dsRNA，产生RNA干扰，使目的基因静默，从而进一步研究目的基因的功能. 根据所选用序列的不同，可将其分为编码区RNAi和启动子区RNAi[13]. 线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究[14].

3.2 研究信号转导通路的新工具 由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，他成为研究信号传导通路的良好工具. 在线虫体内，胰岛素和受体结合后可以活化Dsor1，他是Mek的类似物，Dsor1活化后可以激活EekA，他是ERK的类似物. 用以Dsor1为靶目标的dsRNA可以阻断Dsor1的表达，虽然总的ErkA的表达不受影响，但由于Dsor1的表达被抑制，因而胰岛素刺激后ErkA不能活化[15].

3.3 基因治疗的新方法 用RNAi特异性地抑制如艾滋病病毒基因、肝炎病毒基因、癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种病毒性疾病和恶性肿瘤等疑难病症. 而肿瘤是多基因、多因素疾病，单个癌基因的抑制往往很难达到治疗效果. 但RNAi技术能够同时抑制多个不同基因，而且抑制效果互不干扰. 此外，RNAi识别可以精确到一个核苷酸，对由野生型点突变形成的癌基因，如ras，p53等，能够产生准确有效的封闭效果，野生型基因则不受影响. 实验证明，bcl-2，CDK-2，PLK-1和p53等肿瘤相关基因的RNAi，能够使人类宫颈癌细胞(HeLa)增生速度减慢，恶性程度降低，凋亡加快. 肝癌(Hep3B)、非小细胞肺癌(H1299)、头颈部鳞状细胞癌(C33-A)、骨肉瘤(U-2OS)及前列腺癌(LNCaP)[16]、白血病[14]等细胞系中的实验也发现类似效应. 此外，将RNAi应用于Wilson病等先天遗传性疾病的体外实验也获得令人满意的结果[17-25]. 2002-09，科学家采用这项技术完全清除了生长在试管中的所有癌细胞，而未伤及正常细胞. 随着这一研究结果近日的公布，另一个小组的研究人员正设计这一技术在世界上的第一次临床试验，将在一组艾滋病患者中进行. 由于双链RNA干涉，通过使有害的基因“静默”而奏效，因而科学家认为，可用其来静默感染的病毒基因或已转为恶性的肿瘤细胞，从而使他们变得无害.

总之，科学家预言，一旦RNAi技术能用于临床治疗艾滋病、肝炎和恶性肿瘤，这将是病毒性、寄生病原性、突变基因和癌基因表达等所引起的疾病在基因治疗方面的一场新的革命. 而基因的突变在胰腺癌的发病及发展中均占有重要地位，通过改变癌基因的表达，可以杀灭肿瘤或抑制肿瘤生长或增加癌细胞对化疗药物的敏感性，RNAi将会是胰腺癌基因治疗的又一重要工具.

世界华人消化杂志 2004;12(3):748-750

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MAYMAY提供:

乙型肝炎治疗的新靶点与新方法

引言 乙型肝炎病毒(HBV)在慢性乙型肝炎(CHB)患者体内的持续复制，可以导致不同程度的肝内炎症，而且与肝硬化和肝细胞癌(HCC)的发生密切相关. HBsAg疫苗的广泛应用，在一定程度上能够安全有效地预防HBV感染，降低了感染的发生率[1]，而对于慢性HBV感染者，应用抗病毒化学药物治疗，在抑制病毒活跃复制、阻止威胁生命的肝脏疾病的发展方面也展现了良好的前景[2]. 有效地进行抗病毒治疗，可以诱导疾病缓解，阻止肝硬化进程，防止出现肝衰竭和/或肝细胞癌的严重后果. HBV感染的肝细胞与宿主免疫反应之间复杂的相互作用极大地影响着疾病的临床过程，因而影响了临床处理策略. 目前所用的抗病毒治疗主要是通过干预病毒复制过程或者针对宿主抗病毒的不同环节，达到抵抗病毒、保护机体的作用，但任何治疗方法都有其应用的局限性，使HBV感染始终是困扰人们的难题，寻找新的有效治疗药物也一直是人们不懈追求的目标. 目前只有干扰素a(IFNa)、拉米夫定、阿地福韦(ADV)是获批准的治疗CHB 的药物. 在HBeAg 阳性和HBeAg阴性的CHB患者，这些药物治疗具有相似的短期作用与有限的长期效应，因此，需要寻找新的治疗措施，以克服他们所存在的局限性. 最近几种新的抗HBV复合物正在评估之中，其中包括恩替卡韦，emt-ricitabine(LMV的5-氟衍生物)，clevudine(L-FMAU)以及其他的L-核苷例如L-脱氧胸腺嘧啶(L-dT). 另外，某些免疫调节剂，例如白介素-2(IL-2)、干扰素g(IFNg)、胸腺素a、疫苗等的治疗效果尚有争议[3-4]; DNA疫苗治疗方法，虽然理论上似乎很有吸引力，但在临床应用方面却没有更大的进展[4-5]; 两种聚乙二醇化的干扰素，PEG-IFNa-2b、PEG-IFNa-2a，是治疗慢性HCV的较有前途的药物，最近已经应用于慢性乙型肝炎的治疗. 将来以上这些方法的发展会为临床工作者提供更多的治疗选择.

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MAYMAY提供:

病毒的生命周期

要确认潜在的抗病毒靶点，理解HBV生命周期是很关键的. 成熟的HBV病毒颗粒由整合了病毒表面蛋白的脂质双层包绕核粒核心组成. 核粒内部是结构紧凑、呈松弛环状结构的3.2 kb的部分双链DNA基因组，具有重叠的开放读码框架(ORF)，分别编码HBsAg(L，M，S)，HBcAg，HBeAg，聚合酶和X蛋白.
HBV的复制始于病毒与肝细胞表面的受体黏附，介导病毒进入细胞，脱去核衣壳，转移至细胞核，松弛环状基因组通过宿主细胞机制转化成cccDNA，这个复制中间体是产生各种HBV RNAs的转录模板，包括前基因组RNA(pgRNA)，为病毒复制所必须，也是有效治疗、控制CHB的主要障碍. 3.5 kb的pgRNA的转录发挥三方面的作用: (1)其翻译可以产生核心蛋白与聚合酶蛋白; (2) 参与核粒包装反应，其特异性由一个特殊的位于pgRNA的5’-和3’-末端的称为e茎-环-茎结构所决定，宿主蛋白例如Hsp90可以稳定这种pol-e 的相互作用[6]. 顺式翻译的核心蛋白在pgRNA-pol复合物周围形成二聚体，自我排列形成病毒核粒; (3) 一旦装配成核粒，pgRNA即发挥逆转录模板的作用: 聚合酶蛋白结合至5’-e-结构，作为自身引物起始并合成负链DNA的前3个核苷酸，新生DNA再转位到pgRNA的3’-末端，结合至12 nt的DR1互补序列，负链DNA在此继续合成，聚合酶蛋白的RNA酶H活性使模板pgRNA降解. 这个RNA寡聚体转移至12 nt重复的DR2，开始合成正链DNA. 正链DNA从负链DNA的5’-末端延伸，出现了第3条链转换. 这由在负链DNA模板的一个短的富余片段所促进，这个片段与正链DNA 5’-末端的富余片段退火，因而使基因组环化[7]. 聚合酶蛋白对正链DNA合成的成熟前终止引起特征性的部分双链基因组. 含有部分dsDNA的HBV核粒或者循环回核，增加cccDNA的供应，或者在内质网和高尔基体进一步组装. 成熟的病毒粒通过组成型分泌途径从细胞中运出.

宿主对CHB感染的反应

急、慢性HBV感染导致的肝脏疾病主要是由免疫反应介导，理解对HBV免疫反应的复杂性与多样性，具有免疫治疗意义. HBV感染的动物模型例如HBV-感染猿、HBV转基因鼠的应用，对于研究免疫反应与肝脏疾病、病毒的控制与清除方面具有重要意义[8-9]，但是，动物模型的应用尚存在一定的局限性，尤其在HBV-转基因鼠模型中，缺乏cccDNA的产生与加工等关键的HBV复制事件.
HBV感染的过程受到免疫反应强烈程度的影响. 感染早期、固有的和调节性免疫反应对于HBV的清除是很关键的. 抗原提呈细胞，尤其是树突状细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞，在刺激CD4+辅助性T细胞、CD8+细胞毒性T细胞以控制肝内HBV复制中起着重要的作用. 根据所分泌细胞因子的不同，这些细胞可分为Th1与Th2细胞，诱导原发性细胞介导的免疫反应. Th1细胞主要产生IL-2 ，Th2主要产生白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)和白介素-10(IL-10)，触发体液免疫反应以产生抗体. 当Th1、细胞毒T淋巴细胞(CTL)细胞都活化，并对病毒包膜、聚合酶、核心蛋白产生多特异性抗体，可达到对HBV的清除[10]. 主要活化Th2细胞以产生抗体的免疫反应可能会导致HBV感染的持续，因此，T细胞亚群的不一致性可能是导致新生儿与成人急性感染过程中，HBV持续存在的原因之一.
一般认为，HBV清除是通过CTL活化的穿孔素或Fas-依赖性途径的细胞因子介导的对HBV感染细胞的破坏，而现在有新的观点强调了细胞因子介导的非溶细胞性HBV 清除[9]: 在急性HBV感染的猿猴与HBV转基因鼠的研究中发现，细胞因子，主要是肿瘤坏死因子a(TNFa)，IFNg和IFNa/b，可以不必杀死肝细胞而抑制HBV复制; 在转基因鼠模型中诱导这些细胞因子，能够至少干扰HBV生命周期的两条途径: HBV RNA的转录后降解以及清除含有pgRNA的非成熟核粒，导致HBV核心蛋白的翻译后缺失[10]. IFNa/b可能活化与dsRNA-依赖的蛋白激酶(PKR)和dsRNA-依赖的2’，5’-寡腺苷酸合成酶有关的两条细胞路径，对双链RNA蛋白激酶(PKR)的诱导可能导致HBV蛋白合成的抑制，而对2’，5’-寡腺苷酸合成酶的诱导活化了RNase L以降解HBV RNA. IFNa/b和IFNg可诱导细胞基因的转录改变[11]. 但是，这些细胞因子诱导的作用于HBV复制的“分子抗病毒”的意义还不明确.
通过转基因鼠研究，逐渐阐明了HBV RNA转录后降解的基本分子基础[9]. 研究表明，在TNFa和IFN被诱导后的病毒RNA降解过程中，细胞蛋白-La蛋白，发挥着一定的作用. 在HBV中，这种蛋白特异地结合一个在病毒RNA内的位于转录后调节元件的茎-环结构5’-末端，可能介导HBV RNA的核移出. 最近研究表明，La蛋白上的特异性HBV RNA结合点可能是潜在的抗病毒靶点. 目前，尚不了解在CHB患者中控制HBV复制的非溶细胞过程的免疫反应. 从临床应用角度，面对的挑战应该是建立免疫治疗方案，克服少数炎症细胞浸润或肝细胞坏死的T-细胞低反应性[12-13]，开拓非溶细胞的HBV从肝细胞中清除过程.

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新治疗靶点

HBV生命周期表明，除了逆转录过程，多数病毒过程依赖于宿主细胞机制，其中最重要的是cccDNA的产生与持续存在. 传统的病毒DNA合成抑制物例如核苷类似物能够阻止或降低cccDNA新分子的产生，但是，成功清除已存在的嗜肝cccDNA只能通过非细胞溶解的Th1免疫反应或通过免疫介导的细胞杀伤作用[14-15]. 另外，核苷类似物治疗CHB还能够(部分)恢复(特异性)免疫反应，这一点很重要，这对于介导宿主对感染的持久控制是必要的[16]. 总之，成功治疗CHB的重点是集中到抗病毒与免疫调节方法治疗两方面内容上.

小分子抑制剂

核苷/核苷酸类似物是聚合酶抑制剂，通过细胞激酶代谢成三磷酸形式，能选择性或竞争性抑制病毒聚合酶的催化作用; 类似物的整合(如LMV和ADV)也可以导致新生病毒基因组的链终止; 另外，由于在HBV负链DNA的引物序列的核苷酸是5’-GAA-3 ’，因而嘌呤核苷类似物能抑制聚合酶的引物活性[6-7, 17]. 许多核苷/核苷酸类似物在CHB中的应用已得到检验，例如拉米夫定、阿德夫韦、恩替卡韦、LY582563、MIV-210等.
最近发现另外几种复合物具有HBV抑制的机制，但与病毒聚合酶不相关. 第1种是苯丙酰胺衍生物: AT-61和AT-130. King et al [18]表明AT-61并不影响总HBV RNA的产生或HBV DNA聚合酶的活性，但确实能明显降低核壳化的RNA. 重要的是，AT-61和AT-130对于野生型和多种不同LMV-抗性株具有同样的抗病毒活性[19]. Feid et al [20]应用能够顺式包装HBV RNA的重组杆状病毒系统和一个能够反式包装HBV核心蛋白的表达载体系统观察了AT-130的作用机制: 体外研究表明，AT-130明显抑制了核壳化HBV RNA的产生，但对于总HBV RNA没有作用，也并不影响核心蛋白或核粒的产生，表明其本身能够干扰核壳化过程，其机制可能是通过空间抑制或者与宿主细胞伴随蛋白例如Hsp90相互作用. 苯丙酰胺不是水溶性的并具有极低的生物利用度，成功地发展成抗病毒药还需要克服其潜在的毒性和药物化学事件. 但是，这些发现证明了野生型与药物抗性HBV能够非依赖于病毒聚合酶而被选择性地在复制水平明显抑制.
体内、外实验还表明，另一组复合物，异芳基二氢嘧啶(HAP)，也是潜在的HBV复制的非核苷抑制子[21] ，HAP复合物由Bayer公司发现，包括的候选分子有Bay41-4109及其同种物Bay38-7690、Bay39-5493. 受Bay41-4109作用的HBV感染细胞，通过抑制病毒核粒的形成导致核心蛋白的降解增加，在HBV转基因鼠中也发现这些HAP复合物具有抗HBV的作用[21]. 这种新的作用机制和高度特异性的抗病毒作用表明，HAP复合物可能会进入将来的临床研究. 第3种复合物，LY582563，是一种2-氨基-6-芳硫-9-磷甲氧乙基嘌呤双酯，一种新的核苷类似物，磷甲氧乙基嘌呤的衍生物，其结构类似于ADV. 这种复合物具有极好的抗HBV活性和较低的毒性[22]，对于具有LMV-抗性的HBV也是有效的，其作用机制及早期临床正在研究之中.

基因治疗方法

基因治疗是将新的基因材料导入靶细胞中，以产生对宿主细胞的治疗作用. 抗病毒基因治疗策略如核酶、反义寡核苷酸、干扰肽或蛋白、治疗性DNA疫苗已经被研究用于CHB的分子治疗. 而且，治疗或阻止CHB相关肝硬化或肝癌的分子策略也正在研究之中[5, 23]. 一种新的分子治疗方法是siRNA. RNA干扰是一种序列特异性的基因沉默的细胞过程，小双股RNA靶向一个同源序列，通过细胞核酶使之裂解[24]. 大约22 nt的siRNA导入哺乳动物细胞，能够导致细胞mRNAs特异性地沉默，而没有由长双股RNA激活所诱导的非特异性的干扰素反应，这种方法已经在细胞培养中成功地用于HBV和HCV复制子RNA[25]. siRNA分子可以显著降低病毒特异性蛋白表达和RNA合成，并且这些抗病毒作用非依赖于IFN. siRNA以及传统的基因治疗，虽然是很有前途的治疗方法，但在基因传递、稳定性、毒性、抗性以及安全性等方面仍有很多问题有待解决.

免疫调节治疗

免疫调节治疗的目的是刺激宿主HBV-感染细胞的免疫反应而清除病毒感染. IFNa和胸腺肽a[4-5]已经用于临床，本文强调其他对治疗CHB有用的免疫调节药物. 白介素-12(IL-12)与白介素-18(IL-18)由活化的巨噬细胞和树突状细胞分泌. IL-12通过促进Th1细胞反应在调节免疫系统中发挥重要作用[26]. 在IL-12存在的情况下，IL-18能够作用于Th1细胞、NK细胞和树突状细胞，诱导IFNg的产生[26-27] . 在HBV转基因鼠的研究中表明，IL-12可能通过局部诱导淋巴细胞分泌IFNg，IFNa/b和TNFa而发挥间接抗病毒作用，下调了肝内、外病毒的复制. 在应用IFNa治疗患者中的观察表明，在IFN-a应答者中，IL-12以及IL-2，IFN-g的水平明显高于无应答者[28]. 最近，IL-12在CHB中的I/II 期研究表明，剂量0.25与0.5 mg/kg，治疗12 wk，血清HBV DNA显著降低，但是其总的抗病毒作用低于 IFNa或LMV. 研究表明，短期的IL-12治疗是安全的，副反应与 IFNa相似. 在转基因鼠的研究中，Kimura et al [27]表明IL-18通过IFNa、IFNa/b介导的非细胞病理过程，抑制了肝内HBV复制，这些结果也说明IL-18能协同IL-12抑制HBV复制，表明联合给予IL-18和IL-12对CHB是有治疗作用的.
在病毒感染中，树突状细胞作为抗原递呈细胞，对于刺激调节性免疫方面发挥重要作用. 他们刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞，产生影响Th1/Th2免疫平衡的细胞因子[29]. 除了抗原递呈功能，激活的成熟树突状细胞还能分泌许多Th1和Th2型细胞因子，如IFNa/b，TNFa，IL-1，IL-8和IL-12等. HBV感染时，树突状细胞在影响Th1、Th2反应中的有关资料还很有限，树突状细胞功能的损伤可能导致HBV慢性化[28-30]. 树突状细胞虽然是免疫反应的刺激子，但另一方面他又能通过T-细胞无反应性或T细胞排除诱导免疫耐受性，其介导的耐受性尚不完全了解，而且这些细胞是否能够导致新生儿耐受而引起HBV感染持续尚需进一步探讨. 近年来，树突状细胞在处理免疫反应的效应方面已有临床研究: 体外培养树突状细胞并用抗原(如重组肿瘤与病毒抗原)刺激，然后自体回输，作为几种临床实验的免疫治疗[31]，但树突状细胞在CHB免疫治疗中的作用尚不成熟，应用合适的HBV蛋白激活树突状细胞、克服免疫耐受、诱导多种对HBV的特异性免疫需要深入研究[32-33].
目前，长期抗病毒治疗所致HBV耐药株的出现以及治疗后较低的持续/长期应答率，是HBV治疗中两个棘手问题，也给我们提出了新的挑战. HBV发病机制的深入研究以及新免疫治疗方法的发现，可能会提供一些有用的方法. 另外，在CHB治疗中，目前还不清楚是单独应用核苷/核苷酸类似物治疗，还是应该在核苷/核苷酸类似物基础上加用免疫调节剂，这需要进行深入的临床研究. 在将来的应用中，也有可能进行三联药物治疗，例如两种核苷/核苷酸类似物联合应用PEG-IFN等. 同时，新的抗-HBV 药物的产生，包括非核苷类似物，例如病毒包装抑制剂、免疫治疗(如树突状细胞疫苗)，将来对CHB治疗可能会获得良效.

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参考文献

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原载于"爱干小栈", www.liver411.net

cnstu

太长啦，看的头晕