杀手专题1----乙肝病毒基因型研究

乙肝杀手

乙型肝炎病毒基因型与变异 南方医科大学南方医院　 侯金林 曾国兵 前言 　　乙肝病毒是最小的人类DNA病毒，其基因组全长仅为3200个碱基，以部分环状双链存在。其中负链为完整的环链，包括四个相互重叠的读框：前C/C基因、P基因、S基因和X基因。1988年，Okamaoto等比较了18株HBV全基因序列，将它们分为四组，并命名为A－D， 并指出，依据核苷酸序列异质性≥8% 可将HBV毒株分成不同的基因型，这个分型标准延且至今。进一步研究HBV全基因序列以及它们之间的进化关系，发现另外三个基因型：基因型E、F和G。最近，一种新的HBV基因型在中美洲被发现。 本文就HBV基因型流行病学、分子生物学特征、临床特点以及对抗病毒治疗差异等方面的最新研究进展作一综述。本文结合南方医院感染科在HBV基因型研究方面的工作，主要讨论HBV基因型与慢性乙型肝炎关系研究中一些较为达成共设的发现以及一些尚有冲突的报道(参见Naoumov和侯金林Current Hepatitis Reports 2004, 3: 145-151) 。 流行病学 　　目前对于HBV基因型A－H的认识中，一个最显著的特征是HBV基因型呈一定的地理区域性分布，在不同人种中的流行也存在差异（表略）。A型主要分布于欧洲北部、西部及美国；B、C型主要分布于亚洲；D型是分布最广泛的基因型，是地中海地区和中东的优势基因型，也发现于亚洲少数地区。E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地带且与基因型D有类似的基因特征，异质性最为明显的F型主要分布于南美及中美洲。 　　除了上述主要的HBV基因型外，尚有一些基因亚型被鉴定。一种独特的HBV A基因型亚型在非洲土著居民中被发现并被命名为HBV A’（22，23）。随后在亚洲发现同样的亚群并被命名为Aa亚型（a代表Africa及Asia），将其与在欧洲白种人中发现的HBV Ae亚型（e代表European）分开。HBV Aa及Ae亚型可通过单个核酸多态性差异（SNPs）区分：几乎所有的HBV Ae亚型毒株在nt1809上为核苷酸G，在nt1812为C；而HBV Aa亚型毒株在nt1809及nt1812均为T。根据这些新发现的特点建立了限制性酶切分型技术，能较好地将HBV Aa及Ae亚型区分。 　　HBV基因型B也被分为两个亚型Bj（j代表Japan）与Ba(a代表Asia)。Ba亚型似乎是Bj亚型与HBV基因型C前C/C区重组的结果。Bj亚型在日本HBV B基因型携带者中占很高的比例；而Ba亚型流行于所有其它亚洲国家。从中国的HBV基因型B感染者中通过对前C/C区重组位点的鉴定，在中国东南地区发现另外一个HBV B基因型亚型，被认为是在宿主对前C/C区免疫压力下进化的结果。因而，越来越多的证据表明：不仅在HBV基因型之间，在HBV基因型亚亚之间也存在着地域分布及临床差异。（表略） 　　最近的人口学资料显示HBV基因型与人种以及人口迁移存在一定联系。一份来自香港的对776名慢性HBV感染者调查表明在该地区流行的HBV基因型主要为基因型B-32.5%(其中99%为Ba亚型)和基因型C－62.5%。而在美国的17个肝病中心的联合调查中，在694名连续HBV感染者中发现HBV基因A－G，而且HBV基因型与人种存在很强的联系。其中最多的是基因型A和C，其次为基因型B和D，而基因型E、F和G仅占2%。基因型A存在于白种人与黑种人，基因型B和C几乎均存在于亚洲人。出生于美国的病人中大部分（77%）感染HBV基因型A；出生于亚洲的病人大部分（89%）感染HBV基因型B或C。 　　我们最近中国大陆地区进行了一项研究，样本包括了1096例来自于全国9个省份的慢性HBV感染者标本，结果发现在我国大陆地区流行的HBV基因型有A、B、C、D四种，所占比例分别为1.2%、39.3%、50.2%、8.1%。各地区的HBV基因型分布也大不相同。在北方地区，以基因型C为主，占81.6%；南方则以基因型B为主，基因型C也占相当比例。两种主要的基因型B和C的临床特征比较发现，感染HBV基因型B的人群平均年龄较感染基因型C者小；随年龄增长，基因型C在感染人群中所占比例逐渐增加。在年龄大于30岁的感染者中，感染基因型C者e抗原阳性率显著高于基因型B组，但无论是肝功能受损程度还是肝组织炎症和纤维化程度来看，B型和C型感染者均不明显差异（曾国兵等Journal of Viral Hepatitis 2005）。 　　对慢性HBV感染者的HBV基因型测定可成为追踪人口流动的工具，因为不同的HBV基因型的分布反映出迁移人口的起源地。例如，在南非绝大多数HBV基因型A与D与来自欧洲西北部与南部、印度的移民有关。在新西兰与澳大利亚，基因型A与D同一定比例的基因型C共存，归因于从东南亚地区及亚太地区到该地区的移民。 分子生物学特征 　　一些研究显示，HBV基因型与病毒变异存在着一定的依从关系，特别是发生在C基因启动子区的T1762/A1764变异或发生在前C终止密码子G1896A变异将导致HBeAg表达下调（表略）。 基因型B、C、D与E较易出现前C终止密码子G1896A，而在基因型A则很少发生。这种基因型特异的变异产生的基础在于前C区含有一个发夹形的ε干襻结构，该结构的稳定性取决于nt1858与nt1896配对的情况。在基因型A， nt1858为C能与nt1896的G形成稳定的结构；而在基因型B、C、D与E，nt1858为T与nt1896为G形成的结构不稳定，nt1896的G变异为A可使该结构更为稳定，可以解释该变异在这些基因型中的高流行率。 　　前C区启动子T1762/A1764变异的发生率在基因型A的两个亚型发生率也明显不同，在基因型Aa中更为多见。在ε干襻nt1862的G/A点突变发生于84%的Aa毒株，而在基因型Ae则未有发现，这似乎提示两个亚型之间可能存在病毒复制与HbeAg翻译方面的差异。在基因型Aa最具型特异和最常见的变异为位于前C起始密码上游的T1809与T1812双突变（发生率分别为100%与96%），已往的研究表明该变异能减少HBeAg产生。而在另一个关于基因型A与基因型D的对照研究中，C基因启动子变异的发生率在基因型Aa及Ae均高于基因型D。 　　两个来自亚洲人群的报道指出基因型C较基因型B更易发生C基因型启动子T1762/A1764变异。而在基因B的两个亚型中Ba又较Bj更易出现C基因型启动子T1762/A1764变异。这些报道也说明在日本以外的其它亚洲国家，基因型B与基因型C的重组现象有很高的发生率，因而在感染基因型Ba的人群其HbeAg阳性率要明显高于感染基因型Bj者。 　　基因型特异的氨基酸变异将会影响T细胞表位。例如，HLA－A2限制性CD8+T细胞表位存在于HBV第18－27氨基酸，该表位在基因型A、D（valine at 27）与基因型B、C（isoleucin at 27）是不同的。这些差异可能会影响T细胞对不同基因型感染的免疫应答，但目前尚无相关研究报道。 　　HBV基因型多态性不仅是基因变异，也是基因型之间相互重组的结果。Morzov等分析了99株HBV全序列发现9%的毒株中有基因重组的现象。我们在中国病人的研究发现了基因型C与D重组的证据。对其中8例出现重组的标本进行了HBV全序列测定，与GenBank中已发表的32株HBV全序列进行比较，进化树分析发现以S基因进行分析，都归为D型，但以前C/C和X基因分析则归为C型，利用不同的开放读框做进化树分析，发现这8株均存在基因型重组，利用Simplot软件发现其中7株重组发生在前S2/S区从nt 10 到 nt 799，另1株重组发生在nt 10 到 1499。结果说明基因型间重组体可能有不同的病毒学特点，对HBV的诊断和治疗的影响有待进一步阐明。本研究论著已在Journal Journal of General Virology上发表。 　　其它一些研究也报道了基因型A与D、基因型B与C之间的重组现象。尽管其机理尚不明了，重组现象的发生可能是机体同时或序贯感染多个基因型毒株后长期演变的结果。 　　尽管发生率不高，机体仍有可能同时感染两种不同基因型的HBV毒株。Kato 等分析了8例基因型G感染者HBV病毒分子学特征，发现所有8株HBV基因G毒株均在前C区插入一36bp序列和两个终止密码。研究还显示，所有病人血清HBeAg阳性均为同时感染了基因型A的结果。另外在4例病例中，有3例发现了基因型A与G重组。来自法国的研究也报道了基因型A与基因型G混合感染与重组的现象。 诊断学方法 　　建立精确、简单和经济的基因分型方法对于慢性HBV感染的诊断与治疗具有重要的意义。目前使用的基因分型方法主要包括直接测序、RFLP、基因型特异的PCR，线性探针杂交技术以及酶联免疫吸附法，目前尚未对各分型方法的准确度作出对比与评价。 　　使用线性探针杂交技术检测来自中国和美国的600名HBV感染者证实了其准确性。除了能够对HBV进行基因分型外，该法还能对前C区终止子变异G1896A以及C基因启动子变异进行检测。在该研究中，发现了所有HBV基因型A－H，准确率达99.9%（一例不能检出）。令人关注的是，该方法能检测出多种基因型混合感染，且较直接测序更为敏感。另外的一项研究也证实了这种方法能准确地区分HBV基因型A－G。同前S1/S2区直接测序法相比，两种方法结果有81%样本相符合。而线性探针法在另外19个混合感染样本的检测显示出测序法所没有的优势。目前看来，线性探针杂交法为一种快速、较为准确而且适合临床常规检测的基因分型技术，同时它还能对前C区终止子变异A以及C基因启动子进行检测。 　　此外，还建立了以限制性酶切技术为基础的HBV基因分型方法，但其标准化程度稍差。这种方法主要是通过扩增HBV DNA某一片段后使用特异性内切酶进行分型。近来，区分HBV基因型B的两个亚型的RFLP方法业已建立；使用该法对313名日本HBV基因型B感染者进行分型发现，其中12%为Ba亚型而88%为Bj亚型。进一步的研究发现Ba亚型感染者较Bj亚型者有更高的HBeAg阳性率。这种亚型分型方法有得于对HBV基因型B的分布与特征进行更深入的研究。 值得注意的是由于不同基因型之间重组产生的HBV杂合体毒株可能会影响一些分型方法的准确性。对HBV杂合体感染的基因型分类（如基因型B与C杂合体，基因型A与G杂合体），使用序列不同区段进行测序与进化分析将产生不同的结果。 HBV基因与HBeAg 血清学转换 　　一些对亚洲HBV感染者的研究发现感染HBV基因型B的患者的HBeAg血清自然转阴率要高于感染基因型C的患者，这种现象主要发生在较年轻的患者（表略）。这个现象最初在一个台湾研究中报道，为后来另一包括了146名HBeAg阳性研究对象随访平均52个月的研究所证实。在该项观察中，基因型C的感染者较基因型B者HBeAg血清自然转阴率低，且发生转换的时间要晚10年。在日本，也发现基因型C感染者较基因型B者具有更高的HBeAg阳性率。而另一项来自中国地区的研究也证实以上类似观点为。同样的现象在香港地区也有报道：在年轻患者中感染基因型B者（99%为Ba亚型）较基因型C者有更高的累积HBeAg血清转阴率。与台湾研究有所不同的是，香港地区研究发现基因B与C感染者HBV DNA水平并无明显差异。 　　一项来自西班牙的研究比较了基因型A与基因型D之间的差异。该研究发现基因型A患者较基因型D患者有更高的生化学改善及HBV DNA清除率。另外，该研究还首次发现基因型A患者较基因型D者有更高的HBsAg转阴率。尽管HBeAb的出现率与基因型A或D并无明显关联，在发生血清学转换后持续改善方面，基因型A仍优于基因型D。另一项病例对照研究则比较了基因型A两个亚型之间的差异。研究发现基因型Aa感染者较Ab者HBeAg阳性率低，这可能与在基因型Aa常发生位于前C起始密码上游的T1809与T1812双突变有关。 　　最近，一项来自日本的队列研究发现，在年轻患者中基因型C感染者HBsAg阳性率显著高于基因型D感染者；而在HBsAg阴性患，C基因启动子变异的发生率在基因型C组明显低于基因型D组。 HBV基因型与肝脏病变 　　慢性HBV感染后具有较为广泛的肝脏疾病谱，从几无临床表现的轻症患者到肝硬化甚至肝细胞肝癌。台湾学者Kao首先对基因型与临床结局之间的关系进行了研究。该研究分析了270名主要感染HBV基因型B与C的患者，结果发现在50岁以上肝癌患者中，基因型C比例明显高于基因型B；而与此相反在50岁以下肝癌患者中基因型B则有较基因型C更高的比例。日本一项研究观察了585名HBV感染者以及74名乙肝相关肝癌患者，肝脏病理学证实在进展型肝纤维化患者中基因型B的比例明显低于基因型C中；这种现象只发生于年龄小于45岁的患者，而在大于45岁的患者中两者并未显示出差异；研究者认为基因型B感染较基因型C有更早的血清学转换、更低的肝纤维化程度及肝细胞癌发生率，但在存活期间发展为进展性肝病和肝细胞肝癌的风险两者并无显著差异。一项包括343名香港病例的研究得出相似的结论，在血清HBV DNA水平及肝功能改变方面，基因型B与C并无差异；且在非肝硬化及肝癌患者与肝硬化及肝癌患者组，两基因型分布也未见明显差异。基因型B似乎更易发生前C区终止密码子变异，基因型C则更易发生C基因启动子变异。该研究结论认为尽管基因型B较基因C有较早的HBeAg血清学转换,在向进展性肝病及肝细胞癌的演变两者并无显著差异。 　　HBV基因型对肝细胞癌发生的影响受到许多学者观注，但其中联系仍未十分清楚。最近香港学者对426例病例进行了分析（其中57%为基因型C，42%为基因型B），结论认为基因型C是肝细胞肝癌与肝硬化发展的高危因素之一；这与早些时间台湾的研究一致。但同一地区的其它研究结论则不尽相同。Yuen等研究了90例肝细胞肝癌病例及匹配的180例对象，结果发现基因型C以及C基因启动子变异在肝细胞癌组的发生率显著高于对照组。在感染基因型B（Ba）的病例中，肝细胞癌组C基因启动子变异发生也明显高于对照组。Logistic回归分析显示，与肝细胞肝癌相关的唯一因素为C基因启动子变异，由此可推测基因型C与肝细胞肝癌表现出的相关可能是由于基因型C的HBV毒株更易出现C基因启动子变异。来自台湾的研究也表明感染HBV　C基因启动子变异毒株者，无论其基因型B或C，均有更高的发生肝细胞肝癌的危险。在台湾地区年轻HCC患者中C基因启动子变异的发生率与年长HCC患者类似，但显著高于同等年龄组的静止期感染者（inactive）且与基因型B或C无关。在非洲的黑种人HCC患者中，其C基因启动子变异的发生率也明显高于无症状感染者。 　　有关HBV基因型B与HCC的关系，台湾与日本地区所报道结果也不尽相同。在日本，感染基因型B的HCC患者年龄平均在70岁以上；而感染基因型B者仅为55岁。而在台湾，感染基因型B的HCC患者年龄在50岁或以下，基因型C者则在59岁。这两个地区研究结果的差异可能是由于基因亚型存在所引起。基因亚型Ba存在于日本以外的亚洲地区，而在日本流行的HBV基因型B大部分为Bj亚型。基因亚型Ba较Bj更易出现C基因启动子变异。此外，在基因亚型Ba感染人群中，HCC患者较对照组有更高的C基因启动子变异。这些数据提示在HCC的高危因素中，C基因启动子变异较HBV基因型似乎起着更为重要的作用，这种假设有待的进一步深入的研究证实。 对抗病毒治疗的应答 　　在亚洲感染HBV基因型B或C的慢性肝炎患者对干扰素应答进行回顾性研究显示：基因型B感染者HBeAg血清转阴率较基因型C者高。我们分析了欧洲多个中心随访患者对干扰素应答情况，发现基因型A较基因型D对α干扰素有更好的应答。 　　对于拉米夫定治疗反应，感染HBV基因型B患者与基因型C者相比，两组在HBeAg的血清转阴率并无显著差异。同样的结果也出现在大样本的阿的福韦治疗研究中。两项国际性III期临床试验包括694名患者中，在不同基因型之间HBVDNA抑制与HBeAg的血清转阴率并无显著差异。但是，阿的福韦治疗的时间较短，HBeAg的血清转阴率相对较低；延长治疗时间后，在HBV基因型之间的差异可能显示出来。 最近一些研究还观察了HBV基因型与拉米夫定治疗耐药发生率的关系。在日本，观察213名拉米夫定治疗患者随访一年以上发现YMDD变异的发生率在基因型A、B、C中并无显著差异；但其发生率在基因型Ba中显著高于基因型Bj。在基因型A与基因型D之间也作了相似的研究。析因分素表明，HBV基因型与治疗前HBV DNA水平均与反转录酶区变异发生有关。基因型D感染者更易出现204I变异，而基因型A则更易出现204V与180M变异。这些发现说明在基因型A与D之间，由拉米夫定诱导的反转录酶区变异方式存在一定差异。 　　我们在南方医院收集了247例拉米夫定治疗病例血清标本，应用PCR-RFLP用于筛检拉米夫定耐药变异（YMDD变异），已发现42例感染有YMDD变异株，并进行了治疗前后P基因测序、前C/C变异及基因型分析，结合患者HBV DNA 定量和肝功能变化情况，研究发现治疗前HBeAg阳性和HBV DNA水平超过7.5106 copies/ml者发生YMDD变异的时间较短，YMDD变异出现后ALT水平的上升在HBeAg阳性患者中较明显，而出现YMDD变异后B基因型患者HBV DNA水平上升较C基因型患者更高。P基因测序还发现B基因型和C基因型在YMDD变异的形式上无明显差别（孙剑，等Journal of Medical Virology 2005）。 结论 　　目前的研究结果较为清楚地说明了在HBV基因型之间存在一定的流行病学与临床特征差异（表略）。HBV基因型与人种有很强的关联，通过HBV基因分型研究可以了解人口迁移并能更好地描述HBV感染的地理分布特点。除主要的基因型A－H外，一些亚型也陆续补发现，特别是亚型Ba与Bj、Aa与Ae。许多研究表明亚型与两种基因型的重组有关，这也是HBV病毒变异累积的结果，致使HBV家庭更加多样化。在HBV基因型与病毒变异方式（特别是调节HbeAg表达的变异）之间存在很强的关系，这些变异包括：C基因启动子变异、位于前C起始密码上游的T1809与T1812双突变以及最常见的G1896A终止变异。而HBeAg的转阴率（包括自然的或干扰素诱导）在基因型A显著高于基因型D，基因型B高于基因型C。 　　许多问题仍未十分清楚。需要更深入的研究分析不同HBV基因型之间病毒复制能力及T细胞应答是否存在差异。目前尚无关于HBV基因型之间T细胞应答是否存在差异的研究报道，而T细胞的应答是HBV感染后结局的重要因素。此外，不同HBV基因型的T细胞表位也不明晰。一些HBV基因型重组体被发现，而这些重组体的分布状况以及它们的临床意义仍不清楚。而HBV基因研究最大的障碍来自于其本身分布的地区特异性，大多数研究只能在特定的基因型之间进行比较，如基因型A与D，基因型B与C。开展国际多中心合作研究将有利于阐明所有基因型以及亚型与肝脏疾病发展以HCC发生之间的关系。对于临床工作，有必要建立一种标准化、简单而经济的HBV基因型诊断技术，能准确鉴定HBV基因型与亚型。 　　随着对HBV基因型重要性不断的认识，它将极可能成为HBV感染日常临床诊治工作的一部分；HBV基因型也有于人们进一步理解HBV流行病学与人口迁移；也将对慢性乙型肝炎患者的治疗与管理个体化产生积极的作用。

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乙型肝炎病毒基因型研究进展

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乙型肝炎病毒基因型研究进展

研究发现HBV基因型的类别与HBV传播方式、临床疾病谱、预后判断及抗病毒治疗的选择都有一定的相关性，因此近年来乙肝病毒(HBV)基因型的研究已逐渐成为国内外HBV研究的热点。本文就乙肝病毒基因型研究的历史和现状作一简要综述。

一、HBV基因型的发现与发展 1988年Okamoto[l)等通过对18株不同亚型的HBV DNA全序列比较后发现，亚型的区分并不能真正反映HBV基因组的差异。从基因型角度看，不同血清型间仅是S基因区2个位点上的差异。他们认为，若核昔酸序列异质性>8%，则为不同的基因型，而同一基因型的HBV核昔酸序列的差异<5.6%。因此，将18株HBV分为4种基因型:A^-D型。1992年Norder<Z)发现ayw4和adw4q两种 亚型的S基因彼此之间的差异为6.69/6-7.7%，与A-D 4种基因型的差异在4.0%-8.0%范围内，应归为两种新的基因型，即E型和F型。1994年Norder等[3)对2株ayw4和2株adw4q亚型进行了全序列测定，证明这确实是两种新的基因型，E型和F型与其余4种基因型的差异分别为8.1%-13.6%和12.8%一15.5%。由此将HBV分为A^-F 6种基因型。

2000年Yuasa[4)等研究越南暴发性乙肝的基因突变，发现5位患者的HBVDNA整体分型为C，但其X区却为B型的现象.同年Hannoun等[5]分析了5例越南的HBV全基因序列(亚型均为adw)，发现其中3株在系统树图中呈现位干A, B, C三型之间单独的一枝，可能是一种新的基因型。与此同时Stuyvar等[6J在研究法国和美国患者的血清时，发现了HBV第7种基因型G，基因型G与AF六型最小差异为11.7% (与E型)，最大差异为15.3% (与F型)，基因型G归为adw2亚型。

2002年瑞典的Arauz-Ruizi7l发现3例来自尼加拉瓜和美国洛杉矶的HBV株其小S基因与F基因型HBV有3.1-4.1%的差异。通过全基因序列分析，这3例HBV株之间差异为0.8^2.5%，与F基因型HBV差异为7.2-10.2%，与其它基因型的HBV差异为13.2^'15.7%。经过对82例HBV全基因序列进行两两比较，发现基因型内外的差异分别为0.1-7.4%和6.8^'17.1%，因此这3例HBV株应该属于一种新的基因型，即H基因型。

二、HBV基因型的分型方法 随着基因型概念的提出，测序成为主要鉴定基因型的方法。全序列测定，基因型间的界限是核昔酸序列的差异}8 %。由于S基因序列的变化和全序列的变化一致，因此根据S基因序列即可进行分型，其界限是核昔酸序列的差异)4.2%。但不论是利用全基因序列，还是利用S基因序列进行基因分型，均不可避免面临大量序列测定的实际困难。研究发现，不同亚型有不同的限制性片段长度多态性(RFLP)，故RFLP技术可用于基因分型的研究。现RFLP方法己被广泛应用于HBV的基因分型。

1997年Lindh等181基于扩增S基因的RFLP分析，创立了新的分型方法。但用此方法，仍有一部分血情标本出现非典型限制型和不能分型。由于S基因中前S区异质性高，而S区相对保守，因此前S区能代表S基因的变化，提示前S基因宜于基因分型。1998年Lindh等191又建立了一种以RFLP为基础的HBV基因分型方法，由PCR方法扩增HBV的前S基因，扩增产物分别用两种限制性内切酶平行酶切，根据不同基因型的酶切多态性可分辨6种基因型。其在51例基因库序列及99例HBeAg(+)患者血清中只有两例不能分型，因而此方法是一种有效、简便的分型方法，适用于流行病学调查研究。1999年Masashi等1101对68个 HBV基因库序列进行了全序列及S区的系统树图和RFLP分析，通过5种不同的内切酶分别酶切扩增的S基因，可区分A-F6种基因型。1999年Usudalul设计了以ELISA进行基因分型的方法，采用针对前S2区基因型特异性表位的单克隆抗体。并对514份来自11个不同国家的HBsAg(+)血清进行了分型(缺乏E型)，其中27例未能分型的被证明是不同基因型的混合感染或本方法所涉及的特异性表位发生了点突变。2001〕年Usuda等[121又研究了基因型E，证明该方法能成功区分A- F基因型.2001年Swenson[13]发明了一种线性探针杂交分型方法，他先将血清样品进行PCR扩增，然后用型特异性探针与PCR产物杂交，可区分AF 基因型。2001年Naito[14[研制出了一种简便快速的毕式PCR分型方法，他采用型特异性引物，对样品分两次进行PCR扩增，然后通过琼脂糖电泳根据片段大小直接观察分型结果，可很好地区分A-F基因型。国内也有不少学者在HBV基因分型方法上进行了创新和探索，如朱冰等[15]运用4种限制性内切酶对扩增的S基因片段进行RFLP分析，建立了新的基因分型方法，能很好地鉴别B, C两型。2001年南方医院阎丽[161等建立了一种新的乙型肝炎病毒S基因PCR-RFLP基因型分型方法。结果两种PCR-RFLP及s基因测序鉴定HBV基因型结果一致，表明该S基因PCR-RFLP方法不仅灵敏性高，特异性强，酶切图谱简明单一易于识别，而且准确性也高，适宜于HBV基因型的流行病学调查。

三、HBV基因型的地理分布情况 HBV的基因型有明确的地域性分布特征:A型主要在西、北欧及北美洲和非洲中部流行;B型则主要发现干中国、印度尼西亚及越南，它是变异最多的一种基因型;C型则主要流行于东亚，如中国、韩国、日本、玻里尼西亚和越南、泰国;D型在全世界都有发现，但主要在地中海地区和中东地区流行，并延伸到印度;E型至今则只在非洲有报道;F型发现在美国及玻里尼西亚、委内瑞拉等地。G型见于美国、法国等地;H型发现于尼加拉瓜和美国洛衫矶等地。此外中美洲也有A, C, D型的发现。而在南非主要流行株为A和D型。

在我国，北方以C型为主，南方以B型为主，D型仅见于少数民族地区，如西藏、新疆。A型偶见报道，而E和F型暂未发现.王永忠1171采用巢式聚合酶链反应扩增产物直接测序法对常州地区地区146份不同HBV感染者血清HBV DNA进行了基因分型，结果B型51份(34.90 , C型95份(65.1%)，未发现B, C以外其他基因型。苏冬娜1181等采用ELISA法对深圳114例HBV DNA阳性患者进行基因分型，结果发现B型21例(18.4%), C型72例(63.1%), D型6例(5.3%), BC型9例(7.9%), CD型4例(3.5 )，无法分型者2例(1.8%)。王虹1191采用PCR微板核酸杂交ELISA技术对广州、惠州、珠江等地152例不同临床表现乙肝患者的HBV进行基因分型，结果发现HBV基因型大多集中在B,C,D这3型，其所占比例分别为B型28.29%, C型37.50 %, D型18.42%;A型、E型、F型所占比例很少，各只有3.29%。还存在一定比例的混合基因型，B, C, D三型不同组合的混合型共占10.53%。杨洁1201采用多重PCR法对114例广州周边地区HBV携带者的分型，结果显示主要为B型和C型，分别占45.00%和38.75%，另外还有16.25%的D型。姚刚[211采用PCR- RFLP法对52例HBeAg阳性的新疆维吾尔族HBV慢性无症状携带者的HBV进行基因型测定，结果发现D基因型57.7%, C基因型30.8%, B基因型11.5%，无A. E基因型。

四、HBV基因型与临床关系

2003年，日本长崎国立医学中心的Lin[22]通过分析19例急性乙肝患者的基因型，发现其中18例为C型，仅1例为B型，故认为日本长崎地区急性乙肝患者的HBV基因型主要为C型。2002年，王永忠[p8]等人用巢式PCR加测序法检测了常州地区146例不同乙肝患者的HBV基因型，结果只发现B型(34.9%)和C型(65.1%), B, C两型的ALT, HBV DNA和HBeAg阳性率均无显著性差异，肝硬化和肝癌患者的C型比例(24/28)明显高于慢性乙肝患者(61/104)(P<0.01)，接受拉米吠咤治疗48周后，C型的反跳率(14/45)显著低于B型(18/23) (P<0.001)，因此认为C基因型与肝硬化和肝癌关系密切，拉米吠吮对C基因型患者的疗效强于B型.2003年，香港中文大学的Chan[23]追踪146例HBeAg阳性的慢性乙肝病人32士12个月，结果发现转化为肝细胞癌的6例病人全为C型，慢性病人中C型的病情要重于B型，但HBeAg转阴后则没有差别。

2003年，台湾的Lee[24]用PCR-RFLP法检测了台南地区265例慢性乙肝患者的HBV基因型，结果A型1%, B型60%, C型34%, D型2.5%，无法分型者2.5%,C型的HBeAg阳性率和肝纤维化程度均高于B型，肝细胞癌患者中B, C两型的平均年龄无显著性差异，但50岁以下肝癌患者的C型比例(40%)显著高于同年龄段的无症状携带者(10%) (P<0.001)。经多因素分析发现，由慢性乙肝发展成肝硬化或肝癌的高危因素为老年、男性和C基因型，故认为和B基因型相比，C型与更严重的肝病有关。2003年，香港圣玛丽医院的Yuen[25l用线形探针杂交法检测了288例携带者和55例肝硬化患者的HBV基因型，结果主要为B型(28%)和C型(60%), B型的HBeAg转阴时间比C型早9年(P=0.011), B,C两型的ALT, TBIL, HBV DNA等水平和急性恶化累积风险指标(ALT>- 1.5倍正常值)均无显著性差异，感染后6年内的HBeAg转阴率B型高于C型(P=0.053)，但之后则没有差别。B, C两型在肝硬化、肝癌患者和非肝硬化、肝癌患者中的比例基本相同。作者认为，虽然B型患者的HBeAg转阴时间早，但这并不意味着其病情恶化的风险就明显减小。2002年，刘映霞[26l等人用PCR-RFLP法检测了185例湖南省慢性乙肝患者的HBV基因型，包括携带者42例，慢性轻、中度肝炎38例，重型肝炎80例(伴有肝硬化者49例)，肝细胞癌25例，结果只发现B型(73.5%)和C型(26.5%), B型在重型肝炎和肝细胞癌中的比例(83.7%和76%)明显高于携带者巧7.1%) (P<0.01);

C型在垂直传播感染者中的比例(38.8%)远高于B型(13.2%) (P<0.001), C型的HBeAg阳性 率(57.1%)明显高于B型(30.9%) (P<0.001)，抗HBeAg阳性率(36.9%)明显低于B型(66.2%) (P<0.001), B型的ALT水平(264.51256.5)明显高于C型(100.0士120.6) (P<0.001)。因此作者认为，B型为湖南省HBV优势基因型并与肝脏疾病活动性相关，C型与母婴垂直传播感染有关。2003年，北大肝病研究所的许军1271等人检测了284例乙肝病人的HBV基因型，包括携带者87例，慢性肝炎157例，肝硬化22例，肝细胞癌18例，结果主要为B型(26.1%)和C型(63.2%)，两种基因型在四种类型病人中的比例都有显著性差异(P<0.001). C型在慢性肝炎和肝癌患者中的比例(59.6%, 7.7%)明显高于B型(43.2%,1.4%)(均P <0.001)，但在肝硬化患者中两种基因型的比例(7.7%和&1%)无显著性差异，于是作者认为，C基因型与B型相比，可导致更严重的肝脏炎症。2003年，印度的Gandhel'8}检测了印度西部不同临床表现乙肝病人的HBV基因型，包括携带者19例，慢性肝炎30例，急性肝炎8例，暴发性肝炎5例，结果绝大多数为D型(91.93%)，所有携带者、急性和暴发性肝炎患者以及25例慢性患者均为D型和ayw3/ayw2亚型，剩下的5例慢性患者全为A型(8.07%)和adw2亚型，由于不同临床表现的病人大多数均感染D型HBV,所以他认为基因型并不影响HBV感染的结果。

2003年，日本千叶大学的Sumi[29j检测了258例慢性乙肝患者和74例肝细胞癌患者的HBV基因型，两种病人中B型的平均年龄都显著高于C型(P均<0.05)，慢性患者中B型的HBeAg阴性率和HBeAg转阴率均高于C型(P <0.01, P =0.022);多因素分析显示，B基因型、前C区突变、高水平ALT和严重肝组织病变都是促进HBeAg转阴的独立因素;慢性病人中B型肝纤维化的比例(4/30)显著低于C型(74/224) (P=0.034),这种差异在45岁以下的患者中更趋明显(1/25和47/180) (P=0.020)，而45岁以上则无差异。两种病人中的B, C型比例都大致相同，分别为11.2%a, 87.0%和10.8%, 89.2%。作者认为，虽然B型的HBeAg转阴时间早，发展成肝纤维化和肝癌的进程慢，但是从长远角度来说，两种基因型对病情的影响没有差别。

2002年，西班牙巴塞罗那大学的Sanchez-Tapias[301检测了258例西班牙慢性乙肝患者的HBV基因型，结果A型52%, D型35%, F型7%; A型的ALT, TBIL,HBV DNA等清除率高于D型(P二0.002)和F型(P二0.03); A型的HBsAg清除率高于D型(P=0.03), Cox回归分析显示，HBsAg的持久消退与A基因型有关;

基因型并不直接影响HBeAg向HBeAb的转化，但HBeAg转阴后A型的反跳率低于D型(P 0.03); F型的死亡率高于A型少= 0.02)和D型伊二0.002).2002年，美国密歇根大学的WaiP1]等人用回顾性分析法研究了HBV基因型和前C/C区变异在。一干扰素治疗HBeAg阳性病人中所起的作用。他们检测了107例病人的HBV基因型，其中73例已接受a一干扰素治疗(实验组)，34例未接受任何治疗(对照组)，结果主要为B型(38%)和C型(60%)。实验组中B型和C型的HBeAg转阴率分别为39%和17% (P=0.03)，而对照组中分别为10%和8%(P=0.88);多因素分析显示，B基因型、治疗前ALT升高、治疗前HBV DNA低水平都是抗病毒治疗有效的独立因素，而。一干扰素治疗并不是独立因素。在66例治疗前ALT升高的患者中，实验组B型和C型的HBeAg转阴率分别为57%和21% (P=0.019)，而对照组分别为25%和8 % (P=0.045)。多因素分析显示，B基因型和治疗前低HBVDNA水平可作为抗病毒治疗有效的预测指标。所以Wai认为，B型对a一干扰素治疗的疗效好于C型。2002年，日本九州大学的Furusyo1321采用ELISA法检测了日本福冈和冲绳岛158例慢性乙肝患者的HBV基因型，结果B型和C型的比例分别为36.7%和63.3%，其中冲绳岛以B型为主(86.9%)，而福冈以C型为主(94.8%)。通过跟踪调查这些病人HBeAg和AD，水平的变化，发现观察初期C型的HBeAg阳性率(66.0%)和ALT异常率(84.0%)均显著高于B型(34.5%和22.4%)(P均<0.05), B型每年HBeAg自发转阴率(8.38%)远高于C型(2.34%)。在持续HBeAg阴性的病人中，C型的ALT异常率(58.8%)显著高于B型(19.2%) (P<0.05)。有趣的是，经干扰素治疗后HBeAg转阴的C型病例仍具有较高的ALT异常率(58.8%)。所有ALT异常的病人血清均HBV DNA阳性。这些结果提示，C型的HBeAg转阴所需时间较长，HBeAg转阴后病毒仍持续复制，所以C型可导致比B型更严重的肝脏损害。2002年，香港的Can [33]等人研究了HBV基因型与慢性乙肝感染黄疽性发作(IF)之间的关系。他用RFLP法检测了21例IF病人的HBV基因型，这些病人均ALT升高5倍以上，且总胆红素>501U/L或胆红素升高+PT时间延长3秒。同时将三种临床类型的病人设为对照组，包括31例无症状携带者(ALT 持续正常>2年)、49例活动性早期肝硬化(Child方案A期，HBV DNA>106Eq/ml), 31例失代偿期肝硬化(Child方案B或C期，伴有并发症)。实验组中91%为B基因型，与对照组三种类型皆有显著性差异(P<0.001)，对照组则以C型为主，三种类型之间无显著性差异。

因此Chan认为，B基因型与香港慢性乙肝患者的黄疽性发作有关，而慢性肝病的不同阶段皆以C型为主，这可能与不同基因型HBV的致病机理不同有关。2002年，Kobayashi[301等人检测了日本东京Toranomon医院57例急性乙肝患者和1077例慢性乙肝患者的HBV基 因型，结果发现A, B, C, D, F五种基因型，有少量样品不能分型，急性、慢性的A型比例分别为22.8%和1.9% (P<0.00001), B型比例为14.0%和9.4%,C型比例为43.9%和87.7% (P=0.004), D型比例为1.8%和0.2%, F型比例为1.8%和0.2%a，无法分型的比例为15.8%和0.6%(P=0.001)。急性患者中有7例(12%)呈持续性感染，包括7例急性期接受泼尼松龙和甘草甜素治疗者中的6例(86%)和41名未接受泼尼松龙和甘草甜素治疗患者中的1例(2%) (P=0.01)。对这7例急性感染期延长的患者给予干扰素治疗后，有4例的HBeAg和HBsAg 转阴.在这4例治疗有效的患者中，1例是B基因型，其余3例是C基因型。治疗无效的3例患者中全为A基因型，它们均为HBsAg阳性，且其中1例为HBeAg阳性。因此作者认为，在日本急性乙肝患者中有较多A基因型，干扰素对急性期乙肝治疗效果显著，只有A基因型患者疗效差。

Bahn等1351在研究乙肝患儿从HBsAg到抗.HBS血清转换后HBV持续存在体内的情况时，意外发现在血清转换过程中有3例HBV基因型由A型(亚型为adw)转为D型(亚型为ayw) e Gemer等[361也在研究22例儿童自然或经干扰素治疗而发生HBeAg到抗-HBe的血情转换时，发现7例自然转换的患者HBV基因型由A型(亚型为adw)转为D型(亚型为ayw )，而干扰素治疗组无基因型的改变。Friedt等[371还发现9例暴发性肝炎的婴儿(3-4个月)中有8例的基因型为D型，而唯一幸存的婴儿发生了D^-A的基因型转换，提示基因型D与更严重的疾病过程有关。基因型改变将引起B细胞、T细胞表位的改变，可能会造成病毒免疫逃逸。基因型的改变提示在HBV感染中，还有许多未知的过程有待进一步研究。西欧的主要流行株为A. D型，Mayerat['1对西欧的急慢性乙肝病毒的基因型进行了分析。在35例慢性活动性乙肝患者中28例为A型，而D型只有4例;在30例例急性乙肝患者中24例为D型，仅3例为A型。泰国也有报道在东南亚的慢性乙肝中基因型C占主要地位。说明不同基因型有致病性差异。

Lindh等[391的研究显示，基因C型与B型相比，前者与高A18%突变率及第1762-1764位TGA高突变有关。另外，C型的携带者多为HBeAg阳性且前C区仍为野生型:HAI分值测定显示:C型者炎症分值高于B型者。此外，Lindh等[401还研究了瑞士1995.19%年24例急性乙肝患者，发现急性乙肝的基因型主要为D型。

这些发现也提示不同基因型HBV间存在致病性差异.KaO等[41}报道B,C型为台湾的主要流行株，其中50岁以上的肝硬化(Cir)和肝细胞癌(HCC)患者与同年龄组的无症状携带者(AsC)比较基因型C在前者中占主要地位;而50岁以下的HCC与AsC比较，B型在前者中占主要地位，而在35岁以下的HCC患者中差异更加显著(90%为B型)。结果提示基因型C与更严重的肝病有关，而B型似乎与台湾年轻人的肝癌有联系。1998年范金水等对我国8个城市HBSAg阳性和阴性乙肝患者的病毒亚型和基因型用测序法进行了分析。HBSAg阳性和阴性乙肝的HBV基因型均以C型为主，其次为D型、B型，未发现基因型E,F或新的基因型。总体上看，两类乙肝的HBV主要型别构成基本一致。朱冰等[i5]对广州地区肝硬化患者的调查结果显示，肝硬化患者的HBV DNA主要是B,C混合型，与AsC有差异。近年乙肝基因型与抗病毒药物疗效的研究，提示不同基因型间的药物敏感性也有差异。张欣欣等[421在对35例HBeAg(-)的乙肝患者进行干扰素治疗中发现，A型患者比其他基因型的患者对于扰素有更高的应答率，且不依赖先前ALT的水平和干扰素的剂量。2000年Ka。等[43]比较了B, C 型乙肝患者对干扰素a的应答反应，结论为年龄轻、B基因型感染者可能预示着对干扰素a有较好的应答。

五、HBV基因型与临床关系机理的研究

关于HBV基因型引起不同临床表现机理的研究目前较少，有少数报道认为可能与C区启动子nt1762的A-T和nt1764的G一双重突变以及前C区nt1896的G-A突变有关。前者突变可阻碍前C区mRNA的转运，减少HbeAg 3-4倍的产量，但是只与炎症和肝纤维化有关，而与HbeAg量无太大关系;后者突变可导致终止密码子的提前产生，使HbeAg合成完全受阻，与更轻微的炎症、HbeAg的转阴和病毒的低复制有关;同时还发现C型以前种突变为主，而B型以后种突变多见1- 1基因型A, F病毒株的nt 1858为C 能与nt1896的G形成稳定的茎拌结构，能阻止nt 1896 G^-A的终码突变(又称A1896突变)。B, C, D, E型的nt 1858位为T，不能和nt 1896位的G形成稳定的茎拌结构，易发生A1896突变。前C区nt 1858位点碱基C或T呈现HBV基因型依赖性，提示HBV A18%突变出现受不同基因型筛选。尤其是基因型D的患者在A1896突变的选择下，更易发生持续性肝炎。此外，2000年法国学者还发现A18%突变在D型中的发现率比A型高。

由于欧美主要基因型为A和F,团此抗HBe(+)的慢性乙肝较少，而我国、东南亚、地中海地区主要基因型为B, C, D型，因此抗HBe(+)的慢性乙肝较多。这就解释了A18%突变流行的地区性变化。但有研究发现，在17株F型的乙肝病毒株中有11株有A18%突变，而且都是T1858。从另外5株来自不同美洲国家的F型野生株也发现了T1858。因此C1858阻止A18%突变的能力则只限于基因型A的病毒株。Orito[471等通过对50例日本B. C型慢性乙肝患者的研究显示:B型患者比C型患者HBeAg阳性率低，而抗一HBe则阳性率高。启动子nt1762的止A-T和nt 1764的G-A联合点突变则明显与C型年龄)35岁、重症的肝病有关。此外近年来的研究还发现，疫苗的逃避变异的发生与E型关系密切。2002年6月，日本学者Sugauchit4ej测定了70例B型HBV的基因组全序列，根据前C区和C区与C型有无重组序列将B型HBV分为Ba和刊两种亚型。2003年6月他发现在1838位点处所有Ba亚型均为A碱基，而所有Bj亚型为G碱基，便利用这一点研制出了一种能快速简便区分两种亚型的PCR- RFLP法，并用此法检测了274例B型患者，结果在93例日本慢性乙肝患者中97%为Bj亚型，而在177例中国、泰国、越南患者中几乎100%都是Ba。研究发现，Ba亚型的HBeAg阳性率和核心区启动子双位点(T1762/A1764)突变率均显著高于巧亚型(P<0.05)，在一定程度上解释了相同HBV基因型患者出现不同轻重程度临床表现的现象【491

2003年，日本的Akuta[501通过观察213例A. B. C三种基因型HBV慢性乙肝患者接受拉米吠吮治疗1年后的YMDD突变率，发现三种基因型对拉米吠咤的耐药无显著性差别。相反，B基因型中Ba亚型的耐药率显著高于Bj亚型(P<0.05)。在C基因型患者中，HBeAg阳性的耐药率明显高于HBeAg阴性(P<0.05)，而B基因型的HBeAg阳性和HBeAg阴性患者之间的耐药率基本相同。所有病人中只有4例C基因型患者发展成伴有YMDD变异的急性重症肝炎， 其它基因型则没有1例，故认为乙肝病毒对拉米吠陡的耐药与基因型无关，而与基因亚型有关。从HBeAg阳性率的角度来说，B. C两种基因型患者对拉米吠吮的耐药性有差异。

乙肝杀手

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