干 扰——RNAi漫谈

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RNA干扰在肝癌中的应用

黄锦 林菊生 2004-9-24 10:54:11　中华肝脏病杂志2004年第12卷第9期556页[摘要] 　　近年来，RNA干扰（RNAi）技术已成为癌症基因治疗中令人关注的研究热点，以其高效、特异、应用广泛的特点，展示了诱人的临床应用前景。 　　RNAi是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默机制。RNAi技术有3个重要的特点，首先它具有高效性。从刚开始的21～23nt的小干扰RNA（siRNA）分子，到后来研究应用的27～29nt的小发夹RNA（shRNA）分子，RNAi都具有高效抑制作用，抑制率均在90%以上。其二，RNAi有严格的序列特异性。针对变异基因设计的siRNA或shRNA分子抑制异常基因，而正常基因不受影响。其三，siRNA具有高度的稳定性。它是3′端悬挂TT碱基的双链RNA，化学性质很稳定，不需要修饰。如果加入一个6nt环（loop）的shRNA，则更进一步增加其稳定性和高效性。 　　众所周知，很多原因可以促进肝癌的发生，如乙型或丙型肝炎病毒、黄曲霉毒素、饮用水中的藻类毒素、亚硝胺盐等，这些因素可以使基因产生变异，如点突变、插入、缺失、拷贝数增加、基因易位或重排等，造成癌基因激活和（或）抑癌基因的失活，使细胞无限制生长，从而产生肿瘤。 　　目前，RNAi的研究已进入动物实验阶段，已经通过质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒以及慢病毒等载体将RNAi试用于治疗病毒性疾病、遗传性疾病以及肿瘤等。在我国征服严重急性呼吸综合征（SARS）的战役中，发挥了重要作用。理论上，RNAi可应用于癌症发生、发展和转移过程中任何有基因异常高表达的环节。在肝癌治疗领域中，体现在以下几个方面：(1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因，很显然它是此方面的理想武器。基于RNAi的高度特异性，尽管突变基因与野生型基因通常只存在一个碱基的不同，RNAi仍可以对突变基因产生抑制作用，而对正常细胞中的野生型基因不产生抑制作用。(2)RNAi可应用于抑制插入基因及融合基因的表达。(3)RNAi可应用于抑制基因扩增。基因扩增是指原癌基因通过某种机制在原来染色体上复制出多个拷贝数，导致表达产物异常增多，细胞增殖。设计针对基因扩增中起重要作用基因siRNA或shRNA，可以抑制目的基因表达，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖。(4)RNAi可应用于抑制其他与肿瘤发生发展相关基因的表达，如肿瘤多药耐药基因。(5)RNAi同样可针对血管生成因子及其受体。(6)等位基因特异性抑制(ASI)。ASI是一针对肿瘤细胞中与缺陷基因对应的正常等位基因进行治疗的方法，其前提是该等位基因属杂合子并且是细胞生命活动所必需的。抑制了正常等位基因的肿瘤细胞会死亡，而正常细胞由于等位基因的代偿而不受影响。 　　鉴于RNAi在动物实验中的出色表现，已有不少研究者试图将其应用于临床。但仍存在一些亟待解决的问题：(1)给药途径：基因治疗往往面临转染效率不高的问题，RNAi也不例外。目前的转染途径——脂质体和电穿孔法远远不能满足临床的要求，因此应用临床需要大大提高转染效率。一般用病毒作为载体将生成siRNA的基因运送到细胞中，然后这些基因就在细胞内大量生产siRNA，让目标基因沉默。由于病毒载体可能引起有害的免疫反应，这种方法比直接注射siRNA具有更大的风险，因此开发具有高转染效率、高基因容量和较低毒性的新型载体是RNAi技术应用于临床面临的一大难题。非载体直接注射siRNA也是一种途径，但是较之载体途径存在效率低、持续时间短、成本高的问题。不管是载体还是非载体的方式，通过瘤内注射，或经导管注射可以将基因沉默的药物准确送入特定组织。(2)作用时间：肝癌的治疗一般首选手术，但大部分肝癌确诊时已到晚期，失去手术时机，介入、瘤内注射酒精、射频等姑息治疗疗效有限，RNAi可以弥补这些缺陷。以后的研究可针对发展新的基因表达系统，使RNAi发挥作用时间及其持续时间可调控。(3)安全性：目前RNAi的研究已进入动物模型阶段，其结果令人鼓舞，但是仍需进一步加强动物模型研究，从中总结经验，仔细设计临床试验，确保应用的安全高效。(4)解决多基因治疗：肿瘤的发生是多基因改变多因素协同作用的结果。目前的研究多针对单个基因，因此，RNAi研究者需要努力解决这方面的问题。(5)经费问题也是RNAi应用于临床必须面对的问题。随着RNAi研究的升温，已有不少大公司出售RNAi试剂盒，较之以前已经大大降低了费用。但是仍需进一步发展新的方法，降低成本，为RNAi的普遍应用提供前提。 　　目前，国际一些知名公司如美国的Alnylam公司、Sirna公司及Intradigm公司等，已经开始解决以上问题。Intradigm和德国的Ribopharma两家公司已经宣布将在3年之内进行RNAi药物的临床试验。相信对RNAi的研究热情将促使RNAi药物以很快的速度进入临床试验阶段，大规模的应用包括肝癌在内的临床肿瘤治疗已为时不远。 （收稿日期：2004-07-01） （本文编辑：朱红梅） 作者单位：430030 武汉，华中科技大学同济医学院同济医院肝病研究所

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RNA干扰技术用于肝病治疗的研究

任红 2004-9-24 14:55:54　中华肝脏病杂志2004年第12卷第9期513-514页

[摘要] 　　近年来，病毒性肝炎的治疗研究有了长足的进展，特别是干扰素和抗病毒核苷类药物不断有新的发现，但其疗效仍有不尽人意之处。随着人类基因组计划的完成，基因治疗的领域不断拓展，抗病毒性肝炎及相关肝病的基因治疗研究又有了相应的发展，其中RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术的出现为病毒性肝炎抗病毒治疗研究提供了新的选择。 　　所谓RNAi技术，是指利用21～23bp长双链RNA（double strand RNA，dsRNA）诱导与其有同源序列的mRNA降解的过程。此过程首先利用特定长度的寡核苷酸与酶蛋白形成复合体，然后利用互补识别过程与靶序列结合，再由酶蛋白对靶序列离3′端约12bp处发生酶切作用从而破坏mRNA，达到阻止相应基因表达的目的。整个RNAi过程主要有以下两步骤：(1)dsRNA被切割酶剪切为小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）；(2)siRNA与酶蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC再与靶mRNA结合，利用酶切作用破坏mRNA。由于RNAi作用具有序列特异性，最终破坏的是mRNA，因此它主要被用于两个方面：反向功能基因组学研究和抗病毒研究。与同源基因重组、反义寡核苷酸和核酶等技术相比，RNAi技术更方便、经济和快速。因此，自其问世以来就迅速和大量地被用于研究从线虫到人类的基因，并取得了不菲的成绩。RNAi最初就被证明是植物抗病毒的基本手段。而当其在哺乳动物细胞中也被证实存在以后，就迅速地被用于抗病毒治疗研究[1]。要利用RNAi进行研究，首先必须获取siRNA。目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：化学合成 、体外转录 、长片断dsRNAs经RNA酶Ⅲ类降解、siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs、聚合酶链反应（PCR）制备的siRNA表达框在细胞中表达。前3种方法包括体外制备siRNAs然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞，后2种方法则依赖能够表达siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中[2, 3]。 　　对于乙型肝炎病毒（HBV），Hamasaki等[4]以体外人工合成siRNA，Shlomai等[5]所用的siRNA则由载体pSuper携带相应序列在胞内表达，McCaffrey等[6]所用的siRNA来源于含人U6启动子的表达载体，分别于体外细胞模型和小鼠体内，在mRNA水平、蛋白质水平可检测到siRNA对靶基因的抑制作用。对于丙型肝炎病毒（HCV），McCaffrey等[6]首先证实了RNAi技术在小鼠体内是可行的；Seo等[7]以具有HCV亚基因复制子的Huh-7为细胞模型，发现靶蛋白表达呈剂量依赖型的下降；Wilson等[8]通过HCV感染细胞模型AB12-A2，检测了6个siRNA分子的作用，结果发现不同分子有迥异的表现，同时也证明通过载体表达的siRNA分子可以比直接转染体外化学合成的siRNA分子有更长的作用时间。 　　包括HBV和HCV在内，因RNAi现象发现以来，RNAi用于抗病毒研究国内外已有较多报道，使人们不难认可其用于抗病毒治疗的有效性及应用前景。模拟病毒对siRNA的良好反应说明在进化过程中，要么RNAi未能对病毒施加足够的抗病毒压力，要么病毒以某种手段逃避了RNAi的抗病毒压力。目前为止，尚无通过人体细胞内切割酶形成siRNA分子，达到抗病毒效应的报道。体外合成和胞内转录的siRNA能够发挥抗病毒作用，说明病毒可能是通过干扰siRNA的形成而逃避机体的免疫压力（例如破坏切割酶），而siRNA的体外合成和胞内转录则绕过了这一步骤。在确认RNAi的作用后，其第二步当然是找到具有最佳效果的siRNA作用靶序列。RNAi用于抗HBV治疗有如下优点：第一，它的作用具有序列特异性，且siRNA本身由于片段短，不会引起非特异性的细胞免疫反应。第二，HBV本身长约3200bp,有3.5kb、2.4kb、2.1kb、0.8kb 4种mRNA,可提供数百个RNAi的作用位点；但同时由于HBV的DNA聚合酶缺乏纠错能力，从而具有高度变异性。在选择siRNA的作用位点时首先应考虑保守区域，其次可同时使用多个位点，则可有效防止病毒变异株的出现。早先有研究者认为，siRNA的作用与靶序列的二级结构无关[9]。新近有研究结果表明，RNAi的作用是与其二级结构有关的。第三，RNAi的作用不依赖于病毒的复制，使得该技术可与现有抑制HBV复制的药物（如拉米夫定）联合应用。当然，与拉米夫定一样，RNAi技术也不能从体内清除共价闭合环状DNA。但利用此技术，或许可能建立起用于抗HBV的“鸡尾酒治疗法”。对HCV而言，其高度保守的5′端非翻译区和核心抗原区及NS5B是查找的重点。同样，同时应用针对多外靶序列的siRNA则可有效防止抗性变异株的出现。从理论上讲，任何siRNA分子，只要其对应靶序列不在调节蛋白结合区，都应是有效的。但也可以看到，多个研究小组设计了多个siRNA分子，这些分子对病毒的抑制效应却有明显的差别。究其原因，一方面RNAi的具体作用机制尚未完全清楚，另一方面考虑到机体与细胞内的复杂环境，RNAi的过程似乎也不应像理论上那么简单。RNAi要用于人体治疗，其药代动力学也是研究的重点。目前关于siRNA分子在胞内的有效时间长短不一，短则72h，长则21d。这种差别可能来自所选实验模型的差异，亦或是具体实验方法的不同。关于RNAi用于抗HBV、HCV的研究，目前多限于体外进行。要进一步有所突破，一方面，有必要在更接近人体，同时亦是病毒宿主的大动物模型（如黑猩猩）体内进行实验；另一方面，还需要解决如何安全有效地将siRNA或其表达载体导入人体，定位于肝脏细胞内的问题。 　　RNAi应用于抗病毒，特别是抗HBV、HCV的大量研究成果，让人们看到其重要的应用前景。本期所选用的几篇国内RNAi技术在肝病治疗中的研究报道，涉及病毒性肝炎、肝纤维化及肝癌等领域，已初步显示国内肝病研究对于RNAi这一新技术的重视。尽管目前仍有大量的问题尚未解决，如RNAi作用机制，进入体内的安全性等，但加强RNAi这一新技术的研究，为肝病治疗研究开拓了一全新的方向。 参 考 文 献 [1]Mcmanus MT, Sharp PA. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet, 2002, 3: 737-747. [2]Sharp PA. RNA interference--2001. Genes Dev, 2001, 15: 485-490. [3]Zamore PD. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol, 2001, 8: 746-750. [4]Hamasaki K, Nakao K, Matsumoto K, et al. Short interfering RNA-directed inhibition of hepatitis B virus replication. FEBS Lett, 2003, 543: 51-54. [5]Shlomai A, Shaul Y. Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference. Hepatology, 2003, 37: 764-770. [6]McCaffrey AP, Meuse L, Pham TT, et al. RNA interference in adult mice. Nature, 2002, 418: 38-39. [7]Seo MY, Abrignani S, Houghton M, et al. Small interfering RNA-mediated inhibition of hepatitis C virus replication in the human hepatoma cell line Huh-7. J Virol, 2003, 77: 810-812. [8]Wilson JA, Jayasena S, Khvorova A, et al. RNA interference blocks gene expression and RNA synthesis from hepatitis C replicons propagated in human liver cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100:2783-2788. [9]McCaffrey AP, Nakai H, Pandey K, et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol, 2003, 21: 639-644. （收稿日期：2004-08-06) （本文编辑：朱红梅） 作者单位：400010 重庆，重庆医科大学病毒性肝炎研究所、 重庆医科大学附属第二医院、教育部感染性疾病分子生物学重点实验室 任红 男，教授，博士生导师。

益肝祥

好多坏事都能引出一些好的结果，试想，如果自古以来就不存在战争、饥荒、瘟疫，今天的科技能这么发达吗？如果今天的科技不这么发达，突然间发生一场如同“非典”似的瘟疫，那我们人类还不有灭顶的可能啊！呵呵，谢谢在上的苍天！谢谢！十分感谢！