RNA干扰在基因表达调控研究中的应用
成军
2004-9-24 10:52:56 中华肝脏病杂志2004年第12卷第9期557页[摘要]
在功能基因组学研究中，阐明各种蛋白的结构和生物学功能是其核心任务，这不仅是生物学的主要研究方向，而且也是医学研究的主要内容，毕竟细胞的功能和表型是由细胞中的蛋白来主导的，许多疾病都是蛋白结构与功能、表达水平与调节的异常引起的。研究蛋白的功能，常常通过改变蛋白的表达水平，观察细胞的生物学特性的变化来实现。这种研究策略包括强制性地升高特定蛋白的表达水平，也包括蛋白表达水平的缺失。研究表明，在功能基因组研究中，功能缺失策略具有特殊重要地位。
1. 基因功能缺失的研究策略：基因功能缺失的研究策略主要包括以下几个方面。(1)反义寡脱氧核糖核酸（ODN）和反义RNA（antisense RNA）：反义分子包括反义ODN和反义RNA等。反义技术是指反义DNA或反义RNA分子作用及其机制研究的技术。它是通过以碱基互补配对方式结合，抑制、封闭或破坏目的基因结构及其表达的核酸分子，利用反义技术可了解特定基因的功能，同样也可利用反义技术抑制封闭某些有害或致病基因的表达。(2)核酶：核酶是一类独特的RNA分子，具有自我剪切和催化功能，以其特异性序列通过碱基配对识别并结合靶RNA，催化裂解靶RNA，抑制基因表达，特别是抑制某些有害基因表达。到目前为止，至少提出三种不同的核酶活性中心的结构形式，它们分别是锤头状、发夹状和斧头状结构。这三种主要类型的核酶RNA分子，其基本构成都是由活性中心及其侧翼序列组成，核酶RNA的活性中心决定了酶的催化活性，其侧翼序列决定了核酶RNA结合与裂解靶RNA的特异性。(3) 基因敲除：基因敲除（knock-out）模型是目前功能缺失研究策略中的主要技术途径之一。建立基因敲除的动物模型，基本上通过两种策略：一种是体外构建同源重组或基因打靶（gene targetting）的表达载体，利用受精卵细胞核微注射的方法，依靠受精卵细胞内的基因同源重组，实现基因敲除。这一策略的缺点就是效率太低。随着体细胞核移植技术即克隆动物模型技术的研究进展，目前采用体外构建同源重组或基因打靶载体，在体外条件下对于实现同源重组的细胞系进行选择鉴定，然后进行体细胞核移植，这是基因敲除模型发展的主流技术方向。基因敲除是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计，将该基因去除，或用其它相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。(4)显负性突变体策略：蛋白以及蛋白之间的相互作用决定了蛋白的生物学功能及细胞的表型。一种结构发生变化而失去其正常的生物学功能的蛋白质分子，往往与其相应的野生型蛋白进行竞争性的抑制，从而阻断野生型蛋白的生物学功能。这种具有竞争性抑制野生型蛋白分子生物学功能的突变体称为显负性突变体（dominant negative mutant）。显负性突变体在生物学研究中具有广泛的应用前景。(5)RNA干扰技术。
2. RNA干扰的机制与策略：1995年Guo等在研究秀丽隐杆线虫（C. elegans）的par1基因功能时，将par1基因的反义RNA表达载体导入到秀丽隐杆线虫中，引起par1基因的缺陷现象，同时发现导入par1基因的有义链基因进行表达时，也产生了par1基因的缺陷现象，表明反义和正义RNA的表达都有类似的抑制效应，但是机制却明显不同。Fire等对这一现象的机制进行了细致深入的研究，比较了反义RNA、正义RNA和双连RNA（dsRNA）在秀丽隐杆线虫中的抑制效应，发现dsRNA产生至少有10倍以上的抑制靶基因表达的效果，并将dsRNA抑制同源基因表达的现象称为RNA干扰，从此RNA干扰现象得到了空前的重视，并在各种病原微生物的基因表达抑制方面进行了许多有益的尝试。干扰RNA是生物系统在长期进化过程中形成、天然存在的防御机制之一，从低等生物到高等生物都普遍存在。当一种生物系统受到异源性病原体的入侵时，可以自动开启属于RNaseⅢ的核糖核酸酶，即RNA切割酶（dicer），将入侵病原体的RNA成分切割处理成21～25nt的RNA小片段，发挥RNA干扰（RNAi）的抑制性生物学作用，参与构筑生物系统的防御机制。
3. RNA干扰的机制与策略在肝脏疾病相关基因调控研究中的应用：RNAi能迅速而方便地使某个基因失去功能。因而，能更快的决定基因与表型的关系。RNAi技术还具有的一个优势是能同时对多个基因或基因家族进行研究，或应用于研究mRNA差别剪接形成的异构体，甚至在基因组水平上构建针对基因组的RNAi表达载体，对于研究基因之间的相互作用和进行基因功能的高通量筛查，具有更大的优势。相对于基因敲除技术长期抑制基因功能，RNAi技术仅仅是使基因表达暂时降低或抑制，基因组的信息仍是完整的。利用RNA干扰技术先封闭基因的表达，然后再激活，通过前后基因表型的变化，能很方便的鉴定出基因的功能。在进行反向遗传学研究时，RNA干扰技术也能用来寻找药物治疗靶点，Makimura等利用RNAi技术减少了丘脑下部AGRP基因50%的表达量，AGRP使代谢率提高而不用减少摄食量，从而减轻肥胖，为肥胖的治疗提供了一个靶点。用于疾病机制研究，在鼠模型中，利用RNAi技术干扰Fas通路能明显降低自身免疫性肝炎引起的肝功能衰竭和纤维化程度，说明Fas通路在肝脏疾病中有重要作用。Jean等研究表明，在培养的HeLa细胞中分别转入反义ODN和siRNA，结果siRNA比ODN能更有效的抑制基因表达；在异种移植的小鼠中进行实验表明siRNA在体内能抑制基因表达，但ODN因其对RNA酶的低抵抗性而不能引起有效的基因表达抑制。RNAi技术能使特异的基因封闭，阻止病原体的繁殖或致病基因的表达，为临床治疗此类疾病提供了一种新的可能的方法。RNA干扰只能抑制同源基因的表达，具有较高的特异性，因此能减少非特异作用引起的不良反应。目前的研究主要集中在病毒性疾病和肿瘤性疾病。
在肿瘤的综合治疗中，基因治疗日益受到重视。肿瘤是一种多基因疾病，针对单个基因的基因治疗一般不能取得好的效果，RNA干扰技术可以针对多个基因或基因族的共有序列来抑制多个基因的表达，从而能更有效的抑制肿瘤生长。针对慢性粒细胞白血病的融合基因，设计的小干扰RNA，能够明显地促进白血病细胞凋亡，显示了良好的治疗作用。Cioca等利用粒细胞白血病细胞系研究了Raf-1和 Bcl-2基因在疾病中的作用，表明RNA干扰能诱导凋亡并能提高细胞对化学治疗的敏感性。血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤的发生发展中起着重要作用，已成为肿瘤治疗的新靶点。Zhang等利用DNA表达载体来合成鼠VEGF不同异构体的dsRNA，特异性的封闭了大分子量VEGF的表达，有效地抑制肿瘤的生长。APC 基因是Wnt 信号通路中的重要组分，突变后引起细胞增殖，在肿瘤的发生中起重要作用；Verma等利用RNA干扰技术使这两个基因表达降低，在细胞和裸鼠中都能抑制肿瘤细胞的增殖。以erbB1、端粒酶为靶点，利用RNA干扰技术治疗肿瘤的研究都取得了满意的结果。
（收稿日期：2004-07-02）
（本文编辑：朱红梅）
作者单位：100039 北京，解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心
[此贴子已经被作者于2004-12-18 0:25:17编辑过] | 
楼主: 清照
发表于 2004-3-27 22:35
