乙肝病毒外膜结构

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图2. 乙肝病毒表面蛋白结构示意图。三种乙肝病毒表面蛋白均存在S区。就乙肝病毒表面大蛋白而言，跨膜区（TM1）不作为起始穿膜信号，导致大蛋白preS区面向细胞质。在一小部分表面大蛋白中，大蛋白preS区发生了翻译后易位，穿过了内质网膜。在这种情况下，大蛋白preS区面向内质网管腔。两种形式的表面大蛋白实现了不同的功能。preS区面向内质网管腔的这部分表面大蛋白暴露于成熟病毒颗粒的病毒表面，与吸附过程有关。其preS区面向细胞质的另一部分表面大蛋白调节与核衣壳的接触，并且通过前S2区与蛋白激酶C（PKC）的相互作用启动细胞间信号转导级联反应。

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The Hepatitis B Virus Large Surface Protein (LHBs) Is a Transcriptional Activator

摘要：已有报道称C端截短的乙型肝炎病毒中表面蛋白（MHBst）能作为转录激活子起作用，该功能依赖于MHBst N端PreS2结构域的胞质定位。在野生型MHBs中，PreS2结构域翻译时转移至内质网（ER）腔。最近有报道显示，HBV大表面蛋白（LHBs）的PreS2结构域在翻译完成后先停留在ER膜的胞质面。LHBs是否与MHBst具一样的转录激活功能？我们发现，与MHBst相似，LHBs也确实能激活一系列启动子元件。有证据表明LHBs能PKC-依赖地活化AP-1和NF-κB。PKC下游的c-Raf-1激酶的功能是AP-1和NF-κB依赖LHBs活化的先决条件，因为对c-Raf-1激酶的抑制能消除AP-1和NF-κB的LHBs-依赖的转录水平的活化。


HBV表面抗原基因由一个单独的ORF组成。该ORF被分割成三个分别起始于三个同框ATG密码子的编码区preS1、preS2、s，相应的蛋白结构域为PreS1、PreS2、S。第一个ATG翻译起始合成大的肝炎表面抗原（LHBs），包括PreS1、PreS2和S；第二个ATG起始合成中表面蛋白（MHBs，包括PreS2和S）；第三个ATG起始合成小表面蛋白（SHBs，包括S）。三个HBV表面蛋白都是组成膜蛋白。MHBs具单糖基化和双糖基化两种形式，糖基化发生在PreS2的第4个氨基酸和S的第146个氨基酸；LHBs和SHBs都是单糖基化，糖基化发生在S的第146个氨基酸。令人惊讶的是，LHBs也是单糖基化，尽管它也含有第二个糖基化位点（PreS2的aa4）。最近的研究工作显示，LHBs的PreS1- PreS2定位于细胞质而不在翻译时转移跨过内质网膜（1-3）。该定位使得PreS2 aa4的糖基化位点不能与糖基转移酶靠近。只有一部分的LHBs的PreS1- PreS2在病毒组装时通过分泌途径在翻译后转移跨膜。在病毒颗粒中，有一部分的LHBs的PreS1- PreS2出现在病毒表面。
MHBs和SHBs以亚病毒颗粒的形式被分泌，而LHBs的分泌则需要MHBs和SHBs的共表达。由MHBs和SHBs引发的LHBs的超过量生产导致所有蛋白质滞留在细胞内（4-6）。当preS2/s基因3’端截短时（至少跨膜结构域3的编码区被删除），所获得的MHBs衍生物具转录激活功能（7-9）。与全长MHBs不同，该转录激活子既不能被分泌也不被糖基化（10）。
最近报道显示PreS2结构域足够产生转录激活功能。结构蛋白MHBs与转录激活子MHBst产生功能差异的原因在于N端PreS2结构域定位的不同：在MHBs中，PreS2定位于内质网腔（10，12）；而在MHBst中，PreS2定位于胞质（11）。该定位使得与胞质内的结合伴侣相互作用成为可能。与PKC的直接相互作用对于触发MHBst-依赖的转录激活非常重要(Hildt et al.,submitted for publication)。
   因为与MHBst一样，LHBs的PreS2结构域也定位于细胞质，我们尝试调查LHBs是否也具有MHBst类似的转录激活功能。用1.5μgLHBs表达质粒pSVLM-S-和报告基因pSV2-CAT(0.5μg),p3xAP-1-CAT(1μg),或p2xNF-kB-CAT(1.5μg)共转染HepG2 cells (1.0x106 细胞)。pSVLM-S-能在不产生MHBs和SHBs的情况下表达LHBs蛋白，从而可以在没有HBV蛋白影响的条件下考察LHBs-依赖的转录激活。当pSVLM-S-与报告基因共转染时，我们观察到对CAT报告基因7至9倍的诱导效应。该诱导效应与pSVMHBst76(编码aa76以后被截短的MHBst蛋白)（10）转染后的转录活化效应相近。等量的pUC19作为阴性对照同时共转染(Fig.1a)。
   一系列最近限度的启动子(2xNF-κB或3xAP-1)和SV40早期启动子都能被LHBs所活化。这说明结构蛋白LHBs是一个具多效性的转录激活子。
   现在的问题在于，L蛋白在MHBs和SHBs存在时是否仍然具有转录激活功能。于是用上述报告基因与同时表达LHBs、MHBs和SHBs的pSVLHBs(1)共转染HepG2细胞。与转染pSVLM-S-的细胞相比，稍有降低但仍有6至7倍的转录激活效应被观察到(Fig.1b)。轻微的降低也许反映LHBs合成的减少。
总言之，本研究发现LHBs确实是一个转录激活因子，并且LHBs-依赖的转录活化，与MHBst依赖的转录激活一样，由PKC依赖的c-Raf-1/MAP2-激酶信号转导途径的活化所介导。相同的靶物质（即AP-1 或NF-Κb）被活化；和c-Raf-1激酶一样，PKC对于触发转录激活十分重要。因此，我们可以认为LHBs的转录激活功能是由PreS2区域的细胞质定位所产生的。
   转录激活似乎并不是由引起细胞内分子水平增高的LHBs的内质网滞留所引起。30 mM N-乙酰-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-Cysteine）条件下的共转染实验表明这样的条件对于转录激活功能并没有显著影响（数据未发表）。
   体内LHBs连续的过表达会导致转基因老鼠中毛玻璃样肝细胞（ground glass hepatocytes）的产生(5)，表现为细胞内大量LHBs的存在。在转基因老鼠模型上还能看到肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）的产生。目前认为HCC的发展是由体内LHBs连续的过表达造成的持续煽动过程所引发。因为LHBs的过表达导致一些控制细胞增殖的激酶的活化(PKC, c-Raf-1 kinase)，这些酶的连续活化可能与肝癌的发生具一定的相关性。根据癌症发生机制的多因子模型，LHBs的连续表达可能具有肿瘤促发功能。
   LHBs对于病毒粒子的组装十分重要。根据现有结果，我们预测其第二个功能是通过病毒启动子元件的转录激活参与病毒复制。这似乎与HBx（乙型肝炎病毒X蛋白）相类似。尽管HBx的功能不是HBV复制的先决条件，但HBx通过对病毒和/或细胞启动子的转录激活参与病毒复制(15)。具体说来，在肝细胞刚被感染HBx还没产生时，LHBs能代替HBx发挥作用；其后，LHBs与HBx共同发挥作用。这也许可以解释为什么HBx，至少在体外，不是HBV复制所必需的。还需要注意的是，LHBs的转录激活功能可能使乙型肝炎携带者患HCC的可能性增大，因为这些携带者也是LHBs阳性。