乙肝病毒对核苷类抗病毒药物的耐药性－是难免的！

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　　我们在临床上使用核苷类药物时都非常担心治疗过程中出现HBV耐药株，这是可以理解的。撰写本文的目的是想让大家明白抗病原药物的一种共同特性－即共性，它既可出现于乙肝的抗病毒治疗过程中，也可出现于长期应用抗微生物药物的治疗过程中，这就是耐药相关性变异是难免的,但耐药发生率不尽相同。以拉米夫定为代表的核苷类抗HBV药物的广泛应用在为慢性乙型肝炎患者带来福音的同时,也带来了严重的耐药问题。HBV对核苷类抗HBV药物产生的耐药性是阻碍其临床应用、降低其作用的主要原因。本文以拉米夫定为重点,简要介绍HBV对核苷类抗病毒药物的耐药性研究进展。
    1　HBV产生耐药性的分子病毒学基础
　　大多数生物能够通过复杂的机制来维持其遗传信息的稳定性,而病毒却相反,它们处于快速和持续的基因变异之中。HBV具有独特的生活周期,在复制过程中尽管产生大量的子病毒,但并不直接杀伤被其感染的肝细胞。由于HBV的复制需通过逆转录机制,HBV Pol是一种逆转录酶,缺乏校正的功能,因此HBV变异较为常见,变异率比其他DNA病毒大约要高10倍左右,发生变异的频率大约为(1. 4~3. 2)×10e-5核苷酸替换/位点/年。多数研究结果表明,血清中总的病毒载量可高达10e11病毒颗粒/m,l血HBV池的半衰期大约为1~2d,每日新产生病毒颗粒的数量可能高达10E11病毒颗粒。如此高的病毒载量和更新率以及较低的复制忠实性( replicatiofidelity)等均可增加变异的产生和HBV准种池的容量。在一个HBV感染者的血清中,在HBV准种池内占多数的病毒群通常成为优势株。尽管宿主免疫系统的选择性压力、重叠的读码框架所引起的限制性、存活能力、病毒的复制潜能等维持了HBV优势株的稳定性,病毒复制的数量和速率对优势株的稳定性也是十分重要的影响因素。但相对于其他DNA病毒感染,在内源性(宿主免疫清除)和外源性(疫苗和抗病毒药物)的选择性压力作用下,更容易选择出HBV逃避突变株及耐药株。因此,从理论上讲,对于任何核苷类HBV药  物,HBV均有耐药株的可能性的,所不同的是出现时间早晚的差异。变异病毒的复制必须有可用的复制空间( replication space)。变异株是通过占据原来野毒株的位置而获得复制空间的,此过程的前提是原来野毒株的消失,而原来野毒株能否消失则受其本身的复制适应性、肝细胞的更新、增殖等影响。复制空间可以理解为肝脏容纳新的HBV ccc DNA分子的潜力。新生的ccc DNA分子只能在未感染的细胞、更新的肝细胞、核内ccc DNA已消失的感染肝细胞中合成。所以,一株病毒成为优势株首先要增加其cccDNA合成,然后才能实现病毒量的扩增。换句话说,只有在拥有新的复制空间的前提下,HBV耐药株在肝内的数量才会增加。在所施加的药物选择性压力撤销后(如停用拉米夫定),原来的野毒株是否重新出现、出现的时间以及能否成为优势株,同样取决于是否还存在野生型cccDNA及其所占复制空间的大小。
    2　HBV耐药的定义
    HBV对某种药物的耐药性一般是指这种药物对HBV的抑制作用减弱或无作用,依据判断的方法不同,有三
种类型:
    2. 1　HBV基因型耐药(genotypic re-sistance)　是指HBV基因组中的某些位点发生改变,导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV变异与HBV的耐药性有直接的因果关系,通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。YMDD基序是拉米夫定干扰HBV DNA复制的药物结合点,拉米夫定是通过结合于HBV
多聚酶逆转录活性,使拉米夫定与之结合力下降或造成HBV YMDD基序发生YVDD /YIDD变异,于是HBV对拉米夫定产生耐药性。
    2. 2　HBV表型耐药(phenotypic resist-ance)　用体外细胞培养方法,直接测定某种药物对HBV的抑制作用,即表型耐药,通常以抑制病毒复制率(IC 50)达50%以上所需的药物浓度来评估其敏感性。IC 50低于5倍者仍被认为敏感, 5~10倍升高者为部分耐药,大于10倍以上为耐药。由于检测方法繁琐,费时费力,且代价昂贵,实验条件要求很高,临床上很难开展。
    2. 3　临床耐药(clinical resistance)　指临床出现病毒复制不能被抑制,或HBV复制一度被抑制后又出现HBV DNA反跳,同时并伴有ALT升高。如血清HBV DNA转阴后出现HBV DNA反跳,一般先出现HBVDNA反跳(在105copy/ml以上),继之ALT升高。诊断临床耐药时必须排除拉米夫定治疗中因其他原因引起的ALT 升高,如依从性差,服用损肝药物、酗酒、重叠其他病毒感染、疾病本身波动或正处于HBeAg血清转换期等,最好进一步进行基因耐药或表型耐药检测及分析。
    3　核苷类药物的耐药性
　　在已上市或正在进行临床试验的核苷类药物中,已经报道,拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、依曲西他平、LdT可诱导HBV耐药株。现以拉米夫定耐药为重点,介绍拉米夫定耐药率及其机制、HBV YMDD变异株的复制特性等研究进展。
    3. 1　HBV对拉米夫定的耐药性
    3. 1. 1　HBV对拉米夫定耐药率及其机制
    拉米夫定是目前公认的治疗乙型肝炎的5种药物之一,在短期内可使HBV DNA水平下降,肝功能恢复正
常,肝纤维化程度得到改善。自1999年拉米夫定在中国上市以来,已有近百万慢性乙型肝炎患者接受了拉米夫定治疗,取得了较好的疗效。拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的主要缺陷之一是HBV对其易产生耐药性。随着治疗时间的延长,耐药率明显增加。亚洲的临床研究数据显示,拉米夫定治疗1~4年的基因耐药率分别为 14%、38%、49%和69%。在临床上,YMDD变异常伴有HBVDNA和ALT水平的反跳, 40. 6%的病人出现病情急性加重(Exacerbation),有些病人因并发重症肝炎而死亡。拉米夫定相关变异株引起病情急性加重的机制尚不清楚。目前认为,HBV对核苷类似物耐药性的产生与HBV P基因变异有关,并且HBV P基因变异是多位点的,以C区YMDD基序的变异最为重要。HBV对拉米夫定耐药性的产生也是HBV RT区YMDD基序变异所致。使用新的命名法,拉米夫定相关的HBV耐药株的变异位置和类型为rMt 204I/V(C区)±rtL180M(B区)。最近,还发现一种新的变异类型,即YSDD变异或rMt 204S变异(以往报告的基本是YVDD或YIDD变异),这种变异株是从1例接受拉米夫定治疗18个月的患者的血清中发现的,体外转染研究也证实了这种 YSDD变异株对拉米夫定耐药。
　　HBV YMDD基序变异引起对拉米夫定耐药的机制: YMDD变异可引起HBV聚合酶空间结构的改变,进而引起与核苷类似物之间的作用发生改变,与dNTP或核苷类似物的结合力下降。根据HBV野毒株和 YMDD变异株聚合酶的酶学分析和模拟的HBV聚合酶晶体结构特点,发现YMDD是HBV聚合酶的催化位点,当M变为I或V时可导致氨基酸侧链的柔性减低,并在HBV聚合酶和拉米夫定三磷酸盐之间形成空间位阻,与拉米夫定三磷酸盐的结合力下降。
    3. 1. 2　YMDD变异株的生物学特性的研究
    以往的研究表明,和野毒株相比,YMDD变异株的复制能力显著降低。如有学者报道,在体外,YMDD变异株
对拉米夫定的敏感性比野毒株降低10000倍。研究结果提示,在体外YMDD变异株不能象野生型HBV那样有效复制,复制能力明显下降。在临床上也发现, 发生YMDD变异者在停用拉米夫定之后,病人体内的变异株常常很快被野毒株所取代,提示YMDD变异株存在复制缺陷。近年来,随着对YMDD变异株研究的进一步深入,发现并不是所有YMDD变异株都存在复制缺陷,HBVYMDD变异株的复制能力并不都是减弱的。Bock等最近发现, YMDD变异伴“a”决定簇内变异时,病人可出现病情恶化,体外研究结果显示,这种联合变异可使病毒的复制能力明显增强,与以往的研究结果不一致。Ono 等的研究结果也提示,HBV聚合酶rtLl80M(B区)变异可补偿HBV YMDD变异株的复制缺陷,使HBV的复制增强。其他学者的研究也证实, YMDD基序之外的变异可补偿YMDD变异株的复制缺陷。来自临床研究的证据也支持这一观点,即某些YMDD变异株可能具有较强的复制能力。例如, Thibault等报道,在临床上已发现YMDD变异株引起的急性HBV感染。Lok等对YM-DD变异株的消长状态进行了监测,结果发现,在停用拉米夫定之后,病人体内的YMDD变异株可存在数月之久。因此,YMDD变异株借助YMDD基序之外变异,补偿HBV的复制缺陷,可以解释临床上有些病人出现变异后HBV DNA水平并未明显降低,甚至高于治疗前水平。这也可能是某些YM-DD变异者病情加重的原因之一。以往对YMDD变异株复制的研究在方法上可能存在不足: (1)在检测变异时多数仅检测一段序列,拉米夫定治疗后对整个HBV序列的影响了解不多; (2)即使研究了HBV全基因序列的变异情况,但得到的HBV全基因序列多数是通过拼接而成的,并不能完全代表人体内HBV序列; (3)在研究YMDD基序和YMDD基序之外变异对病毒复制能力的影响时,主要采用人工体外诱变的方法,所用的HBV毒株多数来自同一个人工构建的含 1.2拷贝或以上的HBV全基因质粒,并不能完全反映在拉米夫定的选择性压力下人体内自然出现的变异株的生物学特性。今后有必要直接从患者体内扩增、克隆 HBV全基因,在HBV基因组水平上研究拉米夫定治疗前和变异后HBV的复制特性。
    3. 1. 3　拉米夫定耐药相关性变异所致的S基因变异及意义
　　由于HBV聚合酶基因的读码框架和S基因完全重叠,尤其是HBV RT的7个具有催化功能的基序(G、F、A、
B、C、D和E)完全与HBsAg的主要中和功能域(Neutralisation domain)即“a”决定簇重叠,故HBV聚合酶RT区变异可同时引起S基因变异,例如约有20%的拉米夫定耐药株( rtV173L/rtL180M /rMt 204V)的包膜蛋白可同时发生sE164D /sI195M变异。最近,国外已有研究发现,拉米夫定相关HBV变异株HBsAg与抗-HBs的结合力明显降低,尤其是伴“a”决定簇内变异时,HBsAg与抗-HBs的结合力的降低更明显,如sE104D /sI195M变异株的抗原-抗体IC50与HBsAg经典的免疫逃避株sG145R ( rWt 153Q)相似。当HBsAg与抗-HBs的结合力明显降低时,可成为免疫逃避变异株,导致乙肝疫苗接种失败。由于我国每年有大量乙肝患者服用拉米夫定,是一个急需阐明的问题。
    3. 1. 4　拉米夫定耐药HBV YMDD变异株对其他核苷类药物的敏感性
    临床与实验研究证实,拉米夫定与LdT、FTC、L-FMAU存在交叉耐药性,而与阿德福韦、泰诺福韦、恩替卡韦无交叉耐药性, YMDD变异株仍对这些药物敏感,但敏感性低于野毒株。在临床上,已开始用阿德福韦、泰诺福韦、恩替卡韦治疗拉米夫定耐药株所致的感染。在临床前研究中发现,alamifovir对拉米夫定耐药株也有很强的抗病毒活性。
    3. 2　HBV对阿德福韦的耐药性
    阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)是开环嘌呤类核苷类似物。2002年美国FDA批准可分别用于治疗HBeAg阳性和阴性的乙型肝炎患者。研究报道,HBeAg阳性和阴性的乙型肝炎患者予阿德福韦治疗48周后,其血清平均HBV DNA水平分别下降3. 152和3. 191个log10拷贝/m,l而经过52周的治疗,阿德福韦组HBeAg消失率(24% )稍低于单用拉米夫定治疗组(32% )。阿德福韦治疗2年时,HBeAg消失和HBV DNA转阴(PCR法)患者的比例增加。阿德福韦的抗HBV作用稍逊于拉米夫定,并且与HBV基因型无关。阿德福韦的耐药位点与拉米夫定的耐药位点无交叉,主要出现在RT的B和D区,变异类型分别是A181V和N236T,第2~4年的耐药率分别为2%、7%和15%。体外试验发现N236T变异株对拉米夫定、恩替卡韦、LdT等多数核苷类抗HBV药物敏感。
    3. 3　HBV对恩替卡韦的耐药性
    恩替卡韦是一种脱氧鸟嘌呤核苷类似物,选择性抑制HBV复制。它主要通过对HBV DNA聚合酶引物的抑
制,阻断第一和第二股HBV DNA合成,从而阻断HBV复制。在鸭模型中,恩替卡韦能抑制HBVcccDNA。恩替卡韦还能有效抑制野生株和拉米夫定耐药HBV。与拉米夫定相比,恩替卡韦每日0. 5mg,治疗24周,HBV DNA比拉米夫定组多下降1. 128个log10拷贝/ml。Ⅲ期临床试验正在进行之中。Chang等报道,对181例拉米夫定治疗失效的患者,予每日1mg的恩替卡韦治疗,疗效明显。在500例恩替卡韦受试者中,只有2例对拉米夫定耐药者又出现对恩替卡韦耐药,耐药性出现在治疗80~100周后。恩替卡韦耐药株除了含拉米夫定耐药变异之外(如L180M、M204V/I变异),还同时出现HBV逆转录酶多个部位的变异,如T184A/G/I/S、S202G/I和M250V变异。这种恩替卡韦耐药株仍对阿德福韦敏感。
    3. 4　HBV对依曲西他平( emtricitatine,FTC)的耐药性
    FTC是含氟的胞嘧啶核苷类似物,能抑制HBV DNA聚合酶和HIV逆转录酶。该药已被美国和部分国家批准上市用于治疗HIV-1感染。Ⅱ期临床试验发现,对初治乙型肝炎患者予依曲西他平(200mg/d)治疗48周,能降低血清HBV DNA 3个log10拷贝/m1,并能显著改善肝组织学。然而,由于该药的结构与拉米夫定相似,所以可以出现相同位点的变异和相同的耐药率。200mg/d治疗48周, YMDD变异率为9% ~16%,治疗96周为19%~37%。
    3. 5　HBV对LdT的耐药性
    L-脱氧胸腺嘧啶( telbivudine,LdT)核苷和缬氨酰-L-脱氧胞嘧啶核苷(val-torcitabine, val-LdC)是非常有发展前景的选择性抑制HBV复制的药物。Lai等报道了LdT的Ⅱb期临床试验, 104例患者分为三组每日给药,拉米夫定组, 400mg或600mg的LdT组和两药联合治疗组共治疗52周, LdT组血清HBV DNA下降6个log10拷贝/ml。LdT组HBeAg消失率为33%,拉米夫定组为28%,两药联合组为17%。HBV DNA转阴率(PCR法)LdT组为64%,拉米夫定组为32%,两药联合组为49%。已报道有4%的患者在治疗1年以上出现了LdT的耐药。LdT与拉米夫定有交叉耐药性。val-LdC目前正在进行Ⅱ期临床试验。
　　3. 6　HBV对克拉夫定的耐药性克拉夫定是嘧啶核苷类似物,体内外试验发现能抑制HBV复制。在美洲旱獭模型进行的试验和人体进行的I/Ⅱ期临床试验发现, 克拉夫定治疗4周后ALT复常,且在停药后随访发现能持续抑制病毒复制。最近克拉夫定(30mg、50mg或安慰剂对照)安全性及有效性的双盲、随机的Ⅱ 期临床试验研究发现, 88例HBeAg阳性患者在治疗12周时, 30mg和50mg克拉夫定剂量组的HBV DNA水平分别下降4. 147log10拷贝/ml和4. 145个log10拷贝/m,l治疗结束后随访12周,HBV DNA的水平仍持续下降3. 132个log10拷贝/ml和2. 199个log10拷贝/m,l随访24周时分别下降了2. 128个log10拷贝/ml和1. 14个log10拷贝/ml。此HBV DNA下降的程度对拉米夫定和阿德福韦来说需要52和48周的疗程才能得到。停药后持续的病毒抑制可能得益于磷酸化合物的半衰期较长及代谢活跃。在体外实验中,克拉夫定与拉米夫定有交叉耐药性,目前尚无耐药发生率的临床数据。
    3. 7　HBV对alamifovir的耐药性
    alamifovir是一个由日本首先开发的新的核苷酸类似物,已进入Ⅱ期临床试验。它的结构与阿德福韦相似,是一个含氟的磷酸甲氧基乙酯嘌呤核苷类似物。给予alamifovir每日5 ~20mg,治疗28d,HBV DNA平均下降1. 5~2. 6个log10拷贝/ml。它对拉米夫定引起HBV变异株也有抑制作用,但与阿德福韦有交叉耐药性,对N236T变异株所致感染无效。总之,在用核苷类药物治疗慢性乙型肝炎的过程中,耐药相关性变异是难免的,但耐药发生率不尽相同。影响发生率的因素目前尚未完全清楚,有待于进一步研究。



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