攻克乙肝不是梦，基因编辑靶向“剪切”乙肝病毒

齐欢畅2

攻克乙肝不是梦，基因编辑靶向“剪切”乙肝病毒[p=12, null, left]乙肝病毒

生物探索 · 2015-07-21 10:02

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[p=24, null, left]7月28日是一年“世界肝炎日”，肝炎是肝脏的炎症，最常见的原因是病毒感染。病毒性肝炎分为甲、乙、丙、丁和戊型，虽然病毒种类不同，但都足以对人构成严重危害，其中乙型和丙型肝炎可以导致肝硬化和肝癌的发生，给全球带来严重的疾病负担。

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[p=24, null, left]乙型肝炎病毒简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科（hepadnavividae）。据世界卫生组织（WHO）报道，全球有20多亿人曾受到过乙型肝炎病毒（HBV）感染，大约3.5亿至4亿人罹患慢性乙肝病毒（HBV）感染，在亚洲和非洲发病率尤其高。我国的乙肝病毒感染率约60%-70%；乙肝表面抗原携带率约占总人口的7.18%，以此计算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例。

[p=24, null, left]基因编辑技术助力剪切乙型肝炎病毒

[p=24, null, left]根据6月2日发表在Scientific Reports上的研究结果，该研究小组靶向切割了乙肝病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）的一些特异位点。在一项新研究中，麻省理工学院的研究人员利用CRISPR/Cas9 系统，对受到感染的哺乳动物肝细胞进行基因组编辑，从中删除了乙肝病毒（HBV）DNA。

[p=24, null, left]HBV共价闭合环状DNA是乙肝复发的“元凶”

[p=24, null, left]乙肝患者面临着形成肝硬化或甚至肝癌的高风险。尽管现有的抗病毒药物可以控制乙型肝炎病毒，但却不能完全清除它。因此，一旦停止治疗患者肝脏中的HBV会重新活化。这是因为cccDNA “匿藏”在细胞核中。

[p=24, null, left]HBV的基因组（rcDNA）进入到细胞核后，rcDNA在病毒蛋白和宿主细胞因子的帮助下修复成cccDNA。前基因组RNA（pgRNA）出核后，在胞质中形成εpgRNA，并与病毒的聚合酶P蛋白共价结合，诱发核衣壳化。

[p=24, null, left]与多数其他的病毒DNA的机制不同，HBV cccDNA通过pgRNA的反转录进行复制，而cccDNA主要以微小染色体的形式存在于肝细胞内，且其半衰期很长（33～100天），细胞核内的最长寿命可达14年。只要还存在于肝细胞中，cccDNA乙肝病毒的复制就不会停止，并与病毒蛋白装配成新的完整HBV，以芽生的方式再感染健康的肝细胞，而这是导致乙肝复发的根本原因。

[p=24, null, left]因此，尽管每个肝细胞内只有约5～50个cccDNA拷贝，但是只要这些cccDNA池稳定，就可以使得病毒的持续感染延续，因而清除肝细胞内的cccDNA是乙肝彻底治愈所必需的。

[p=24, null, left]CRISPR/Cas技术——基因编辑的“神器”

[p=24, null, left]CRISPR/Cas技术是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统，它可利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白对靶位点序列进行修饰。

[p=24, null, left]其中的一个关键因子就是Cas酶，能用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一个就是称为导向RNA（gRNA）的RNA分子，这种分子能通过互补结合靶标。

[p=24, null, left]随着以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术靶标特异性不断得到提高，其在血液病、肿瘤、传染病和其他遗传疾病等一系列与人类健康和疾病相关的基因治疗的应用领域展现出极大的应用前景。

[p=24, null, left]CRISPR/Cas9——靶向切断慢性HBV感染

[p=24, null, left]论文的主要作者之一Vyas Ramanan说：“我们为未来利用CRISPR/Cas9来靶向切断慢性HBV感染提供了强有力的理论依据。”Ramanan和同事们设计了24条单链向导RNAs（sgRNAs）来靶向从在线病毒序列信息资源库中鉴别出的一些HBV基因组位点。

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[p=24, null, left]经过初筛测试后，研究小组将三个最有效的sgRNAs和Cas9蛋白插入到慢病毒载体中，然后将它们转导到了整合HBV的人类肝细胞内。Ramanan说：“对包含整合基因组病毒DNA的稳定转染细胞系展开实验，我们看到HBV总DNA和cccDNA逐渐减少，在36天时cccDNA下降了92%。”研究小组还观察到病毒基因表达和复制均显著减少。“进一步地在从头感染模型中我们开展研究，在第9天我们看到这些病毒参数同样大幅度降低。”

[p=24, null, left]现在，Ramanan计划在人类肝嵌合小鼠模型中测试这一方法，以评估和优化传递方法和给药方法，及更好地了解需要除去多少的cccDNA才能到达人类功能性的治愈。他表示，尽管还有很多的工作要做，但其认为这是一个有趣的开始。

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因编辑神器CRISPR能否“助力”治愈乙肝？
北京健康新闻中心2015-09-27 17:19:14乙肝 研究 系统 阅读(791) 评论(1)
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　　基因编辑神器CRISPR能否“助力”治愈乙肝？
　　
　　近日，李兰娟院士在浙大一院庆祝感染科成立60周年大型肝病讲座和义诊中表示：“再过十几年的时间，我们要让中国摘掉‘乙肝大国’的帽子。”事实上，为了能够彻底治愈乙肝，很多科研人员都在从事这方面的研究。近期，风靡科学界的基因编辑神器CRISPR也在该领域发挥了至关重要的作用。
　　
　　Scientific Reports（9月3日）
　　9月3日，在Nature子刊《Scientific Reports》上发表的一篇论文中，研究人员在HBV基因组的S和X区中确定了交叉基因型保守的HBV序列，可被Cas9切口酶靶定进行特异性和有效的切割。这种方法不仅能破坏细胞系中的游离cccDNA和染色体整合HBV靶位点，而且也能破坏慢性感染和新感染肝癌细胞株中的HBV复制。这些数据表明，可以使用CRISPR/Cas9切口酶，作为HBV感染的新型治疗策略。
　　在这项研究中，研究人员调查了改进的CRISPR/Cas9切口酶系统，可选择性地靶定和灭活记者细胞系和慢性感染的肝癌细胞株中的游离以及染色体整合的HBV序列。研究人员证明，HBV的S和X基因的两个高度保守区域，可以用于Cas9n介导的HBV灭活，从而支持一个概念：设计酶的进一步临床开发，最终可能根除感染患者体内的HBV。[文献]
　　World J Gastroenterol（8月28日）
　　8月28日，发表在《World J Gastroenterol》杂志上的一篇论文中，研究人员用双gRNAs导向CRISPR/Cas9系统抑制了乙型肝炎病毒复制。论文的通讯作者是北京大学医学部病原生物学系鲁凤民（Feng-Min Lu）教授，其主要从事病毒性肝炎的实验室诊断、HBV感染相关肝癌发病机制等研究。
　　在这篇文章中，研究人员评估了CRISPR/Cas9系统清除HBV A-D基因型的基因组的潜力。他们总共设计出了对抗HBV A-D基因型的15种gRNAs。选出了覆盖HBV调控区域的11个双gRNAs组合。通过测量HBV表面抗原(HBsAg)或培养物上清液中的E抗原(HBeAg)检测了每种gRNA和11个双gRNAs抑制HBV（A-D基因型）复制的效力。利用PCR和测序方法检测了在共转染双gRNAs和HBV表达载体的HuH7细胞中HBV表达载体的破坏情况。并利用KCl沉淀、PSAD消化、滚环扩增结合定量PCR的方法在HepAD38细胞中检测了cccDNA的破坏情况。并评估了这些gRNAs的细胞毒性。
　　结果显示所有gRNAs都可以显著减少培养物上清液中HBsAg或HBeAg生成，这取决于gRNA对抗的区域。所有的双gRNAs都可以有效的抑制HBV A-D基因型生成HBsAg和/或HBeAg，与单gRNA相比，双gRNAs抑制HBsAg和/或HBeAg生成的效力大大提高。此外，通过PCR直接测序技术，他们证实了这些双gRNAs可通过除去两gRNAs切割位点之间的片段来破坏HBV表达模板。更重要的是，gRNA-5和gRNA-12组合不仅可以有效抑制HBsAg和/或HBeAg生成，还能够破坏HepAD38细胞中的cccDNA储存库。
　　这些结果表明了，CRISPR/Cas9系统可以有效破坏HBV表达模板，且没有明显的细胞毒性。它有可能是在慢性HBV感染患者中根除持续存在的HBV cccDNA的一种潜在的方法。[文献]
　　
　　Scientific Reports（6月2日）
　　6月2日，发表在《Scientific Reports》杂志上的一项新研究中，麻省理工学院的研究人员利用CRISPR/Cas9 系统，对受到感染的哺乳动物肝细胞进行基因组编辑，从中删除了乙肝病毒(HBV)DNA。该研究小组靶向切割了HBV病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)的一些特异位点。
　　研究人员设计了24条单链向导RNAs (sgRNAs)来靶向从在线病毒序列信息资源库中鉴别出的一些HBV基因组位点。经过初筛测试后，研究小组将三个最有效的sgRNAs和Cas9蛋白插入到慢病毒载体中，然后将它们转导到了整合HBV的人类肝细胞内。
　　论文的主要作者之一Vyas Ramanan说：“对包含整合基因组病毒DNA的稳定转染细胞系展开实验，我们看到HBV总DNA和cccDNA逐渐减少，在36天时cccDNA下降了92%。”研究小组还观察到病毒基因表达和复制均显著减少。[详细]
　　Gene Therapy（2月5日）
　　2月5日，来自军事医学科学院放射与辐射医学院研究所、第四军医大学西京医院、日本京都大学和华中农业大学兽医学院等处的研究人员，在Nature旗下子刊《Gene Therapy》发表一项最新研究成果。 在这项研究中，研究人员探讨了靶定HBV抗原（HBsAg）编码区的CRISPR/CRISPR相关Cas9系统，在细胞培养系统和活体动物体内的效果。结果表明，CRISPR/Cas9可在体内和体外抑制HBV复制和表达，可能是HBV感染一种新的治疗策略。
　　在这项研究中，研究人员探讨了靶定HBV表面抗原（HBsAg）编码区的CRISPR/CRISPR相关Cas9系统，在细胞培养系统和动物活体内的效果。研究人员通过定量酶联免疫吸附测定，分析了细胞培养基和小鼠血清中的HBsAg水平。利用定量PCR和HBsAg表达，研究人员评估了小鼠肝脏组织中的HBV DNA水平。
　　结果发现，经过CRISPR/Cas9处理后，细胞培养物和小鼠血清所分泌的HBsAg量降低。免疫组化分析结果表明，在CRISPR/Cas9-S1+X3处理的小鼠肝脏组织中几乎没有HBsAg阳性细胞。CRISPR/Cas9系统可有效地在HBV DNA中产生突变。因此，CRISPR/Cas9可在体内和体外抑制HBV的复制和表达，从而可能是HBV感染一种新的治疗策略。[详细]
　　
　　我国乙肝防控进展
　　根据中国疾病预防控制中心的统计数字，目前，中国有9000万乙肝病毒感染者，760万丙肝病毒携带者。近年来，我国乙肝报告发病率呈下降趋势，2014年最新调查成果显示，全国1至4岁儿童的乙肝表面抗原流行率降到了0.32%，与2006年相比下降了66%，5至14岁流行率降到了0.94%，下降了61%。
　　在不久前召开的国家卫生计生委例行新闻发布会中，中国疾病预防控制中心副主任高福院士表示，全国疾控系统在重大传染病方面取得了一些突破；其中，为改进乙肝疫苗剂量，使5岁以下儿童乙肝表面抗原携带率降至1%以下，提前3年达到WHO西太地区乙肝防控目标；成功研发60微克乙肝疫苗，将疫苗接种应答率由此前的78.6%提高到92.8%。
　　2020年要实现孕产妇乙肝检测率达95％以上
　　6月16日，卫计委在其官网上发布了《预防艾滋病、梅毒和乙肝母婴传播工作实施方案（2015年版）》。《方案》指出，至2020年底，要实现孕产妇乙肝检测率达95％以上，孕期检测率达90%以上；要实现乙肝感染孕产妇所生新生儿乙肝免疫球蛋白注射率达95％以上。
　　今年的世界肝炎日，国家卫计委副主任王国强指出，我国实施的以预防接种为主的综合防控病毒性肝炎策略取得了显著的效果。从2015年开始，我国采血机构都运用新的方法来筛选血源，能够进一步降低通过输血来传播乙肝的风险。然而，肝炎防控还面临许多挑战，需要多措并举，进一步加强病毒性肝炎防控。
　　WHO发布首份乙肝治疗指南，提出五点主要建议
　　除了我国对乙肝防控的重视；今年3月，世卫组织发布了有史以来第一份慢性乙肝治疗指导。这项指导文件涵盖了所有治疗内容，从确定哪些人需要得到治疗，到使用何种药物以及如何对感染者进行长期监测。提出的主要建议有以下五点：
　　1.使用几种简便、非创伤性检测法来评估肝脏疾病的分期，以协助确定哪些人需要得到治疗;
　　2.将肝硬化患者的治疗列为重点——肝脏疾病的最晚阶段;
　　3.使用替诺福韦或者恩替卡韦这两种安全且高效的药物，对慢性乙肝实施治疗;
　　4.利用早期发现肝癌的简便检测法开展定期监测，以评判所作治疗是否有效以及是否需要停止治疗。
　　5.还考虑到了一些特定人群的专门需求，比如艾滋病毒合并感染者、儿童和青少年以及孕妇。
　　本文由中国国际生命医学工程院专家为你收集的医学科学新闻知识，转载于网络，仅供参考，希望对你有所帮助。若本文有著作版权问题，并非有意为之，实为公益传播知识而转载，请作者联系告诉我们，我们会及时通知编辑删除，敬请谅解。

齐欢畅2

已成全球围剿之势。

newchinabok

目前还是梦

齐欢畅2

刷屏。

齐欢畅2

为了刷屏而刷屏。

齐欢畅2

纯粹刷屏。

yelin1208

期待

ivanich

wto2015年已经预测5-10年内就要干掉hbv……

重韧

目前就是我们论坛中在围剿。。