诊断病毒性肝炎的新核酸检测技术

2002落叶

上海复旦大学附属华山医院 施光峰

     近年来,一些新的核酸检测技术逐渐运用在乙型病毒性肝炎(乙肝)和丙型病毒性肝炎(丙肝)的诊断上,下面介绍相关进展。

    

    诊断乙肝的新核酸检测技术

     血清HBV DNA实时定量检测

     常用的血清HBV DNA定量检测的敏感范围为103~106拷贝/ml,而实时聚合酶链反应(PCR)HBV DNA检测的敏感范围可增至50~109拷贝数/ml。因此,实时PCR技术在诊断隐匿性乙肝方面意义重大,在检测血液捐赠者中是否存在慢性肝病的病因学诊断方面有重要的应用价值。

     肝内共价闭合环状DNA检测

     过去研究HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的障碍主要有两点,一是要通过肝活检获得肝组织;二是缺乏敏感、特异、定量的方法从活检组织中检测出cccDNA。

     近年来,一种新的检查方法可通过两个主要步骤检测cccDNA。首先,通过脱氧核糖核酸酶降解非共价闭合环状DNA。然后,将引物定位在松弛环状DNA的断端,进行cccDNA扩增,用实时PCR技术通过标记探针定量检测病毒DNA。但是,此检查结果需通过定量检测一定数目细胞β球蛋白基因标化校正。

     HBV基因型与基因序列检测

     基因序列分析依然是分析病毒基因的金标准,其主要优点是可检测出新的变异株,这对服用过抗病毒药物治疗的患者检测出未知的耐药突变株特别重要。

     但是,此检测方法耗时,所有相关的区域都需进行PCR扩增和基因序列分析。目前正在研究更简单的分析HBV基因序列的方法。

     线性探针技术

     线性探针检测技术可检测乙肝病毒的基因型、前C区变异、基本核心启动子(BCP)变异和多聚酶基因变异。其优点是即使只有5%的病毒变异,它也可以检测出来。该检查方法的特异性、可重复性和敏感性均较好。

     因此,如果患者血清乙肝病毒载量开始升高,可用线性探针检测技术早期诊断病毒耐药。其缺点是只能检测已知的变异,如果要检测新的耐药变异株,需设计新的探针。

     DNA芯片技术

     DNA芯片技术是一种更强有力的分析HBV的基因技术。HBV DNA芯片技术可复式扩增整个HBV基因,一个高密度的HBV芯片可检测多达200个变异株的151个位点及病毒基因型。其优点是可一次分析整个HBV基因序列,缺点与线性探针技术类似,只能分析已知的病毒株,对新的病毒株需设计新的相应的芯片。

     表型分析

     目前表型分析方法有非载体介导和载体介导两种。非载体表型分析是PCR扩增整个HBV基因,然后将扩增产物转染人体外肝细胞,进行药敏试验。而载体介导的方法是将HBV多聚酶基因或整个HBV基因克隆至质粒载体,然后转染人细胞,进行药敏试验。这些方法可用来研究病毒对药物耐药和交叉耐药的情况。