DNA疫苗的研究进展

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扬州威克生物工程有限公司
王慧萍
DNA疫苗（DNA vaccines）常被称作“裸” DNA疫苗（naked DNA vaccines）、基因疫苗(genetic vaccines)、核酸疫苗（nucleotide vaccines）、多核苷酸疫苗 (polynuleotide vaccines)、基因免疫(genetic immunization)、核酸免疫(nucleic acid immunization)、多核苷酸免疫（polynucleotide immunization）等，虽然名称和概念多种多样，但其本质却是一样的，即把外源的抗原基因克隆到质粒或病毒载体上，然后将重组的质粒或病毒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生以天然蛋白形式出现的抗原，激活机体的免疫系统，并能够持续地引发免疫反应。在1994年5月的世界卫生组织会议上，与会专家都充分肯定了DNA疫苗应用的潜在价值，并认为DNA疫苗的研究和未来实施的应用一种疫苗预防多种传染病的计划是一致的。
1 DNA疫苗的发现和发展
1990年Wolff等观察到给小鼠肌肉注射纯化的RNA或DNA表达载体，可在肌细胞内产生相应基因的表达产物，氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶及β-半乳糖苷酶，且可持续很长时间，据此他们提出了用编码抗原的基因在细胞内表达可成为研制新型疫苗的手段。其后，1991年Williams等及1992年TangDC等分别报导了外源基因在体内编码的蛋白可诱导免疫应答。1993年Ulmer等将编码甲型流感病毒核蛋白(NP)的质粒注入小鼠体内，产生了强烈而特异性的细胞毒T细胞（CTL）应答，并且可有效地保护小鼠抵抗另一亚型流感病毒的攻击。至此，DNA疫苗作为第三代疫苗的地位便得到了确认。
1995年美国Merck和Vical公司的研究工作者用携带流感、单纯疱疹及艾滋病毒蛋白基因的DNA免疫猴子，消除了人们对DNA疫苗在灵长目动物身上能否成功的疑虑。同年Sizemore等报导，用减毒志贺氏菌介导携带β-半乳糖苷酶基因的载体，在进入哺乳动物(小鼠、豚鼠、猴)细胞后，释放在细胞浆中质粒载体上的外源基因得到高效表达，作者认为此项方法将为口服免疫及粘膜免疫提供潜在能力。几乎与之同时，我国李植峰等以减毒鼠伤寒沙门氏菌(X4064株)为介导，将携带萤火虫荧光素酶CDNA的真核表达载体PED-Lue通过腹腔注射感染小鼠，发现该真核表达载体在菌体裂解之后，可存在于腹腔巨噬细胞、肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏组织细胞中，直到感染后60天，仍能测到这种荧光素酶，这同样表明减毒鼠伤寒沙门氏菌有用作DNA疫苗介导菌的可能。1996年几种DNA疫苗——流感疫苗、艾滋病疫苗、Ⅱ型单纯疱疹病毒疫苗已开始进行人体试验。1997年，Tollais应用含pre-2+S基因的DNA疫苗可以使某些转基因小鼠的慢性乙肝病毒彻底清除，这为治疗人类乙肝病毒感染提供了新的希望。Le等用编码疟疾抗原的DNA疫苗免疫20个成年人，进行了Ⅰ期安全和耐受治疗研究。Roy等进行的乙肝DNA疫苗人体实验也显示出良好的效果。而目前在美国就有Merck、Vical、Apollon、Agracatus等数家公司参与研制DNA疫苗的激烈竞争。
2 DNA疫苗的作用机理
DNA疫苗由外源抗原编码基因和作为真核表达载体的质粒构成。表达载体依靠特有的病毒启动子启动外源基因在动物细胞内高水平表达。通常认为DNA疫苗进入真核细胞，仅有少量被细胞所摄取，其中少量进入细胞核后，在载体上启动子的调控下，转录出抗原基因mRNA，后者进入胞浆而转译出相应的抗原蛋白。抗原呈如下几种方式提呈给免疫系统：①抗原在细胞内经加工后与MHCI分子结合提呈到细胞表面，刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)；②蛋白质从细胞中释放出来与B细胞受体结合，刺激B细胞；③部分释放出的蛋白质被抗原呈递细胞所吸收、降解，然后与MHCⅡ分子结合后刺激辅助性T细胞，从而激发辅助性T细胞的增殖，并伴有细胞因子的分泌，主要的细胞因子是白细胞介素-2和干扰素，这属于一种典型的TH1型辅助T细胞反应。
此外，DNA疫苗接种的剂量小，但被体内转染细胞启动出的免疫反应却强而有力，其原因在于质粒DNA通过免疫刺激序列（ISS）产生的佐剂起了一定的作用。在某种程度上来说，用于DNA免疫目的的质粒DNA从概念上可分为两个部分，一是转录部分，指导相应的抗原蛋白在体内表达，二是佐剂部分，辅助机体对抗原产生免疫应答。
3 DNA疫苗的特点
3.1可作为治疗性疫苗
对 HbsAg转基因小鼠肌肉注射HbsAgDNA疫苗后，小鼠体内出现抗HbsAg抗体，肝细胞内HbsAg mRNA降低，血清HbsAg滴度下降。这个现象提示DNA疫苗可能应用于HBV慢性感染的治疗。
3.2操作性强
DNA疫苗的制备仅涉及核酸操作，对于结构及免疫性质尚不清楚的病原体，这种方法更简便、有效。如以内切酶部分消化肺炎支原体基因组DNA，将产生的随机片段构建表达文库进行免疫，能使小鼠免受活肺炎支原体的攻击。DNA疫苗也是研究单个蛋白质抗原免疫应答的有用工具，尤其对于保护尚不明确的抗原或难以纯化的抗原。DNA疫苗的化学组成也决定了它的性质稳定、造价低廉，这是基因工程重组疫苗、减毒疫苗远不能及的。
3.3能有效诱导体液免疫和细胞免疫
DNA疫苗进入宿主细胞后能表达外源抗原，其过程与病原微生物感染极为相似，有利于外源蛋白质抗原形成天然空间构型而保持其自然免疫源性。这种内源性抗原被抗原提呈细胞（APC）加工，处理后形成的肽分子能与APC内的MHCⅠ类及MHCⅡ类分子结合而被共同运输到细胞表面，活化B细胞和CTL前体细胞。目前常用的疫苗如灭活疫苗等作为外源性抗原被APC吞噬后，经内粒体加工，形成的肽分子一般仅与MHCⅡ类分子结合而只能诱导体液免疫。减毒活疫苗虽然能诱导细胞免疫，但有恢复毒力的危险，不适用于孕妇和免疫功能缺陷者。痘病毒、腺病毒等病毒载体疫苗也能诱导细胞免疫，但同时表达多种抗原性很强的病毒特异性基因产物，可能干扰免疫反应或使疫苗失活。而DNA疫苗不表达无关抗原，不形成完整病原体，因而没有病毒载体疫苗和减毒活疫苗的危险性。
4 DNA疫苗研制的技术路线
4.1 目的基因的选择：目的基因是重组DNA中编码保护性抗原的序列，目的基因的筛选实质上是比较分析不同保护性抗原编码基因在被免疫动物体内的表达与诱导保护作用的过程，从中筛选出最理想的一个或几个。试验证明，单个的抗原基因或许不足以产生足够的保护性免疫反应，多个抗原基因的选择对于免疫反应也许很重要。而在实验过程中还必须确认目的基因序列中是否含有多余的内含子，以及该内含子在哺乳动物细胞内是否影响外显子在转录成mRNA时的连接，如果候选基因片段是PCR产物，也必须经测序而得到确认。
4.2 选择合适的真核质粒表达载体：表达载体对DNA疫苗的效能有很大影响，而控制外源基因表达的启动子对载体的影响更大。载体必须含有真核启动子，如CMV、RIV、SV40等， 质粒DNA不能整合到宿主细胞染色体并能持续稳定地表达目的基因，CpG基元（motif）可增强免疫。一般以含有CMV启动子的pcDNA3作为表达载体。
4.3 将目的基因与表达载体相连，构建重组子，提取重组子后用离子交换层析法等方法纯化，然后转染哺乳动物细胞以检测相应蛋白质的表达，可以选择含有半乳糖苷酶基因或绿色荧光蛋白基因作为报告基因的表达载体为对照，分析转入DNA是否表达。
4.4 疫苗接种的途径和方式：肌肉注射是最常用最简单的方法，小鼠通常在股四头肌进行注射；皮肤转入是用基因枪将吸附了DNA疫苗的金微粒轰击皮肤，此法具有能够引发较强的体液免疫和细胞免疫应答的优点；粘膜转入是用基因枪法或注射法将DNA疫苗转入呼吸道、消化道或生殖道粘膜，诱发局部及全身性免疫应答；除上述方法外，还有注入腹肌、心肌、静脉等方法的报道，而不同途径的接种其效果亦不同，主要是与不同细胞的DNA摄入和表达高低及转染细胞将抗原提呈给免疫系统的能力有关。导入再生肌肉组织或利用高渗蔗糖溶液可增加细胞对质粒的摄入。
4.5 动物模型的选择及免疫周期和免疫次数。可选择小鼠（BALB/C、C57BL/6、 H-2K和H-2b品系）、鸡、兔、羊、猪、猴、猩猩等病原体易感动物作为模型，免疫周期为4~6周，免疫次数以1~3次为佳。
4.6 免疫佐剂：细胞因子（IFN-γ、IL-2、GM-CSF等）脂质体和黏附分子（ICAM）等都可作为核酸疫苗的佐剂。
4.7 免疫保护效果的检测：可检测体液免疫和细胞免疫的功能，同时还可采用PCR技术检测转入的DNA在局部组织存在的情况，用免疫组织化学法检测抗原蛋白的局部表达。
5 DNA疫苗的应用前景
已有的实验结果表明，DNA疫苗不仅有可能作为病毒、细菌或寄生虫病的预防用疫苗，同时也有可能作为感染性疾病、肿瘤等疾病的治疗用疫苗；它既象一种亚单位疫苗，又更象一种减毒疫苗，DNA疫苗与传统的疫苗相比有许多优点：①安全可靠，其生产过程中不需要大量病原体的培养，无减毒活疫苗可能引起的致病作用；②更为有效，可引起细胞免疫及体液免疫反应；③制备简便，只需要对编码抗原的基因进行设计和克隆，不需要在体外表达和纯化蛋白；④价格低廉、使用剂量低、便于运输保存、易于构建和大规模生产；⑤DNA疫苗可能作为细胞内的“抗源储藏器”，抵抗抗体的廓清，在没有免疫接种的情况下，连续不断地产生蛋白产物刺激免疫系统，从而保持长期的免疫记忆，甚至可终生免疫；⑥不同DNA序列组成的混合DNA疫苗可对付变异抗原的侵袭；⑦可针对相同或不同病原体的几种抗原进行联合免疫。
但是，对于DNA疫苗的应用仍然有许多忧虑：重组DNA是否有可能整合到宿主DNA的染色体上，从而造成插入突变；机体是否有可能产生对注射的DNA本身的免疫反应，产生抗DNA的抗体，从而诱发自身免疫性疾病；对DNA疫苗的免疫机制不甚了解，表达抗原在机体内高水平长时间的存在是否有可能会造成机体的免疫耐受性，如何控制表达的时间与水平亦有待于解决；质粒是否有可能激活原癌基因或灭活抑癌基因。
总之，DNA疫苗作为近几年来发展起来的一项新的生物技术，无疑具有广阔的应用前景。但在短期内，DNA疫苗很难代替目前大量使用的传统疫苗，随着DNA疫苗研究的不断深入，预计不久将会有新的突破。