400038 重庆,第三军医大学西南医院全军感染病研究所 王宇明 张耀 HBV和HCV是引起慢性病毒性肝炎的两大主要原因。目前全球分别有慢性HBV患者约3.5~4亿,慢性HCV患者约1.7亿。其中,成年人感染HBV后约5~10%发展为慢性肝炎,婴儿感染HBV后大多数成为慢性携带者;而HCV感染后约50~90%发展为慢性肝炎。大量的研究表明,细胞免疫应答的特性决定了这两种疾病的转归。当细胞免疫通过有效地溶胞或非溶胞机制清除了病毒,感染便得到控制;反之,病毒则长期存在。T细胞在特异性免疫应答中起关键作用,不仅负责细胞免疫,对B细胞参与的体液免疫也起辅助和调节作用。感染者CD4+T细胞不足会使抗体产生障碍并影响CD8+T细胞活性;病毒特异性CD8+T细胞应答低下则导致循环病毒量增加,使机体难以清除病毒。目前认为,不同免疫系统组合的广泛作用是成功的细胞免疫应答之关键。因此,对HBV和HCV感染的细胞免疫进行比较研究,对阐明病毒性肝炎的慢性化机制及其防治策略,无疑具有重要意义(图1)。同时,病毒特异性CD8+T细胞的检测的进步,使反映T细胞功能和T细胞扩增功能得以实现(表1)。 表1 病毒特异性CD8+ T细胞的检测 检 测 | 定量 | 反映T细胞功能 | 反映T细胞扩增功能 | 四聚体 | + | - | - | 细胞因子 | + | + | - | ELISPOT | + | + | - | CTL分析 | - | + | + |
一、CD4+T细胞应答 到目前为止,对病毒感染中CD4+T细胞应答的研究不多,尚未形成系统的定论。然而,已有的研究仍然明确了CD4+T细胞激活增殖具有重要意义。在经典的免疫应答途径中,树突状细胞(APC)提呈抗原并激活T细胞,构成特异性免疫应答的重要环节。虽然由MHC-Ⅱ分子限制性抗原提呈导致的CD4+T细胞克隆增殖明显少于并慢于由MHC-Ⅰ分子限制性抗原提呈导致的CD8+T细胞克隆增殖;然而,这两类抗原引起的T细胞应答在病毒感染时都应该存在,只是在感染的不同阶段两类应答凸现的重要性不同而已。 (一)HCV HCV急性感染者纵向研究结果表明,病毒清除与活跃、特异的CD4+T细胞应答存在时间上的关联;HCV特异性CD4+T细胞应答在频率、强度和范围上与HCV特异性CD8+T细胞的细胞毒性、增殖反应以及IFN-γ分泌有很强的相关性,这是CD4+T细胞可促进CD8+T细胞应答的有力证据。Thimme等对5位HCV医源性感染者的研究表明,其中自限性感染者体存在早期、活跃、多特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞反应;而进展为慢性感染的患者体内无明显的T细胞应答或CD4+T细胞增殖反应微弱。在HCV感染初期,四聚体阳性CD8+T细胞表达CD38分子,而不产生IFN-γ以及病毒清除效应;随着CD4+T细胞发生增殖反应,CD8+T细胞由CD38+IFN-γ-表型向CD38-IFN-γ+表型转换,这种转换导致CD8+T细胞分泌IFN-γ和病毒清除反应的发生,这就提示CD4+T细胞可能通过诱导CD8+T细胞的抗病毒效应而导致病毒清除。此外,急性自限性感染者与慢性患者比较,前者某些HLA-Ⅱ等位基因(如HLA-DQB1*0301、HLA-DRB1*1101)表达明显增强。这些等位基因可增强APC的抗原递呈能力,刺激机体产生特异、持续的Th细胞应答,在抗HCV感染发挥重要作用。 针对特异性表位的CD4+T细胞应答,在治疗慢性HCV感染中取得了良好的效果。在黑猩猩试验中发现,当肝内CD4+T细胞功能被抑制后,尽管有大量特异性CD8+T细胞应答存在,然而,黑猩猩仍表现出持续、低水平的病毒血症;在缺乏足够的CD4+T细胞条件下,CD8+T细胞对HCV的抑制作用是不完全的,且容易出现MHC-Ⅰ类限制性免疫逃避突变(immune escape mutations)。人群的横断面研究也证实在急性感染者中存在活跃的CD4+T细胞应答,而慢性感染者CD4+T细胞应答在频率、强度和范围上要低得多。然而,有研究发现,一些慢性HCV患者体内也存在大量HCV特异性CD4+T细胞,但不发生抗原特异性增殖反应及分泌IFN-γ,而HCV急性感染者或恢复期患者CD4+T细胞表现出强烈的增殖反应和分泌IFN-γ的作用。这表明一些HCV慢性患者体内CD4+T细胞被大量激活后转入无能(anergy)状态,而另一些则出现了免疫耗竭(exhaustion)。有报道指出,CD4+CD25+T细胞可通过细胞间接触机制抑制HCV特异性T细胞应答,导致感染慢性化。在免疫选择压力作用下,HCV感染者体内的Th表位发生变异,丧失了对CTL和体液免疫的辅助和调节作用,可使HCV逃避宿主免疫攻击,这也是感染慢性化的原因之一。 (二)HBV 急性HBV感染者病毒清除反应与多克隆、多特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞应答有关,HBV自限性感染者大多表现出显著的特异性T细胞反应。通过对急性自限性感染者研究发现,CD4+T细胞针对核衣壳抗原发生强烈的增殖反应,但对病毒包膜抗原很少发生应答。在发生血清学转化的患者,CD4+T细胞以及细胞因子产物对HBcAg和HBeAg的应答最为强烈,这可能是导致病毒清除以及肝病缓解的原因之一。除了具有直接的效应因子的功能,抗原特异性CD4+T细胞对病毒特异性CD8+T细胞的活化也是必不可少的。通过残余的病毒抗原诱导HBV特异的记忆性T细胞表达,对HBV感染的长期控制有重要作用。某些HLA-Ⅱ类等位基因型表达也影响HBV感染的结局,HLA DRB1*1301-01和HLA DRB1*1301-02等位基因表达可上调APC对病毒抗原的递呈能力,抑制病毒增殖。在急性感染恢复期,外周血与肝脏HBV特异性T细胞迅速减少,但在病毒抗原存在时机体仍保持高水平的T细胞反应。 通过测定病毒感染相关抗原的增殖以及胞内细胞因子的表达,表明强烈的、多特异性的CD4+T细胞应答与病毒清除相关;在慢性HBV感染者中,CD4+T细胞增殖以及细胞因子表达常常不能被测出。有研究指出,肝内Th1细胞和Th2细胞的比例是决定HBV感染是否慢性化的主要原因之一。当特异性Th1细胞在肝内占优势时,使CTL细胞清除病毒的功能增强,但同时也加重了肝脏的损伤;当特异性Th2细胞在肝内占优势时,抑制细胞免疫发生,减小肝脏损伤,导致感染慢性化。通过对转基因鼠研究发现,HBeAg主要诱导Th2细胞产生和活化,抑制Th1细胞因子对病毒的清除。Webster等对4位最终完全清除了体内HBV的急性感染者进行研究,发现只有1位患者体内存在HBcAg特异性的CD4+T细胞,但未发现HBsAg特异性CD4+T细胞,这提示CD4+T细胞在抗HBV感染中的作用可能不如在抗HCV感染中强。 二、CD8+T细胞应答 CD8+T细胞在控制HBV、HCV感染中的具有核心作用。在病毒感染过程中,CD8+T细胞最先产生反应,其主要针对病毒抗原肽与MHC-Ⅰ类分子形成的复合物产生应答。CD8+T细胞激活增殖的结果对病毒感染以及特异性免疫反应具有重要意义。同时也应该看到,病毒特异性CD8+T细胞效应是一把双刃剑,它们在控制和清除病毒的同时,可通过穿孔蛋白介导的细胞毒反应以及Fas /Fas受体介导的靶细胞调亡机制引起肝组织的持续性损伤。然而,目前研究表明,非病毒特异性CD8+T淋巴细胞在肝脏损伤中起主要作用。近年来的研究发现,IFN -γ、TN F-α介导的非溶胞机制在病毒清除中也扮演重要角色。 (一)HCV 急性HCV感染时,活跃的CD8+T细胞应答对抑制HCV持续性感染是必需的。在对黑猩猩的研究中发现,当使用抗体封闭动物体内CD8+T细胞功能后,即使动物体内已存在经病毒抗原预处理的Th细胞,感染动物体内病毒呈持续复制状态,直到肝内病毒特异性CD8+T细胞恢复功能后病毒复制才被抑制。在CD4+T细胞的协同作用下,当分泌IFN-γ的病毒特异性CD8+T细胞进入肝内后,发生病毒清除反应。通过细胞内IFN-γ染色发现,病毒特异性CD8+T细胞仅少量或短暂增加的感染者不能清除病毒。经ELISPOT测定病毒特异性CD8+T细胞的IFN-γ表达结果进一步表明,自限性感染者体内CD8+T细胞出现频率显著高于慢性感染者。体外试验表明,在HCV抗原肽刺激下,12名自限性感染者中有11名出现明显的CTL应答,但6名慢性感染者中仅1名出现明显的CTL应答。发生病毒清除反应的患者体内表达活跃的CD4+T细胞和CD8+T细胞,不同的病毒特异性CD8+T亚群分别介导免疫病理过程和病毒清除反应,在细胞毒机制和非溶胞机制的共同作用下控制HCV感染。有研究发现,HCV急性感染时病毒特异性CD8+T细胞的增殖能力、CTL活性、分泌IFN-γ和穿孔素蛋白等功能削弱;当感染者CD8+T细胞功能全面提高后发展成自限性感染,而功能未改善的感染者则发展成慢性感染。 在HCV慢性患者中,四聚体阳性病毒特异性CD8+T细胞占总CD8+T细胞的比例约为0.01~1%,不足以清除病毒;此外,血清低滴度HCV RNA患者体内的CTL反应比血清高滴度HCV RNA患者要活跃。慢性患者中四聚体阳性HCV特异性CD8+T细胞在增殖能力、CTL活性、分泌IFN-γ和穿孔素蛋白等方面功能下降。有报道指出,随着病毒被清除,四聚体阳性T细胞分泌IFN-γ会出现短暂的中止;然而,也有研究者指出,不论病毒完全清除与否,四聚体阳性T细胞分泌IFN-γ和IFN-α功能将会持续下降。这些研究均提示HCV特异性CD8+T细胞功能减弱可能是导致HCV容易慢性化的原因之一。CD8+T细胞识别的特异表位突变可能是导致HCV慢性感染的又一原因。NS3 1073-81是急性HCV感染CD8+T细胞的共识别表位,但慢性患者中CD8+T细胞对此表位的应答率很低,进一步研究发现此表位突变是导致低应答的原因。值得注意的是,目前关于HCV清除的免疫应答研究在特异性和广度方面都远远不足;特别是对那些不但影响免疫应答效率和范围,而且影响免疫逃避突变频率的表位仍需深入研究。慢性HCV感染的潜在细胞免疫缺陷见表2。
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