细胞免疫在HBV和HCV感染慢性化机制中的作用

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400038 重庆,第三军医大学西南医院全军感染病研究所
王宇明  张耀
HBV和HCV是引起慢性病毒性肝炎的两大主要原因。目前全球分别有慢性HBV患者约3.5～4亿，慢性HCV患者约1.7亿。其中，成年人感染HBV后约5～10%发展为慢性肝炎，婴儿感染HBV后大多数成为慢性携带者；而HCV感染后约50～90%发展为慢性肝炎。大量的研究表明，细胞免疫应答的特性决定了这两种疾病的转归。当细胞免疫通过有效地溶胞或非溶胞机制清除了病毒，感染便得到控制；反之，病毒则长期存在。T细胞在特异性免疫应答中起关键作用，不仅负责细胞免疫，对B细胞参与的体液免疫也起辅助和调节作用。感染者CD4+T细胞不足会使抗体产生障碍并影响CD8+T细胞活性；病毒特异性CD8+T细胞应答低下则导致循环病毒量增加，使机体难以清除病毒。目前认为，不同免疫系统组合的广泛作用是成功的细胞免疫应答之关键。因此，对HBV和HCV感染的细胞免疫进行比较研究，对阐明病毒性肝炎的慢性化机制及其防治策略，无疑具有重要意义（图1）。同时，病毒特异性CD8+T细胞的检测的进步，使反映T细胞功能和T细胞扩增功能得以实现（表1）。

表1   病毒特异性CD8⁺ T细胞的检测

检   测	定量	反映T细胞功能	反映T细胞扩增功能
四聚体	+	-	-
细胞因子	+	+	-
ELISPOT	+	+	-
CTL分析	-	+	+

一、CD4+T细胞应答

到目前为止，对病毒感染中CD4+T细胞应答的研究不多，尚未形成系统的定论。然而，已有的研究仍然明确了CD4+T细胞激活增殖具有重要意义。在经典的免疫应答途径中，树突状细胞（APC）提呈抗原并激活T细胞，构成特异性免疫应答的重要环节。虽然由MHC-Ⅱ分子限制性抗原提呈导致的CD4+T细胞克隆增殖明显少于并慢于由MHC-Ⅰ分子限制性抗原提呈导致的CD8+T细胞克隆增殖；然而，这两类抗原引起的T细胞应答在病毒感染时都应该存在，只是在感染的不同阶段两类应答凸现的重要性不同而已。

（一）HCV

HCV急性感染者纵向研究结果表明，病毒清除与活跃、特异的CD4+T细胞应答存在时间上的关联；HCV特异性CD4+T细胞应答在频率、强度和范围上与HCV特异性CD8+T细胞的细胞毒性、增殖反应以及IFN-γ分泌有很强的相关性，这是CD4+T细胞可促进CD8+T细胞应答的有力证据。Thimme等对5位HCV医源性感染者的研究表明，其中自限性感染者体存在早期、活跃、多特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞反应；而进展为慢性感染的患者体内无明显的T细胞应答或CD4+T细胞增殖反应微弱。在HCV感染初期，四聚体阳性CD8+T细胞表达CD38分子，而不产生IFN-γ以及病毒清除效应；随着CD4+T细胞发生增殖反应，CD8+T细胞由CD38+IFN-γ－表型向CD38－IFN-γ+表型转换，这种转换导致CD8+T细胞分泌IFN-γ和病毒清除反应的发生，这就提示CD4+T细胞可能通过诱导CD8+T细胞的抗病毒效应而导致病毒清除。此外，急性自限性感染者与慢性患者比较，前者某些HLA-Ⅱ等位基因(如HLA-DQB1*0301、HLA-DRB1*1101)表达明显增强。这些等位基因可增强APC的抗原递呈能力，刺激机体产生特异、持续的Th细胞应答，在抗HCV感染发挥重要作用。

针对特异性表位的CD4+T细胞应答，在治疗慢性HCV感染中取得了良好的效果。在黑猩猩试验中发现，当肝内CD4+T细胞功能被抑制后，尽管有大量特异性CD8+T细胞应答存在，然而，黑猩猩仍表现出持续、低水平的病毒血症；在缺乏足够的CD4+T细胞条件下，CD8+T细胞对HCV的抑制作用是不完全的，且容易出现MHC-Ⅰ类限制性免疫逃避突变(immune escape mutations)。人群的横断面研究也证实在急性感染者中存在活跃的CD4+T细胞应答，而慢性感染者CD4+T细胞应答在频率、强度和范围上要低得多。然而，有研究发现，一些慢性HCV患者体内也存在大量HCV特异性CD4+T细胞，但不发生抗原特异性增殖反应及分泌IFN-γ，而HCV急性感染者或恢复期患者CD4+T细胞表现出强烈的增殖反应和分泌IFN-γ的作用。这表明一些HCV慢性患者体内CD4+T细胞被大量激活后转入无能（anergy）状态，而另一些则出现了免疫耗竭（exhaustion）。有报道指出，CD4+CD25+T细胞可通过细胞间接触机制抑制HCV特异性T细胞应答，导致感染慢性化。在免疫选择压力作用下，HCV感染者体内的Th表位发生变异，丧失了对CTL和体液免疫的辅助和调节作用，可使HCV逃避宿主免疫攻击，这也是感染慢性化的原因之一。

（二）HBV

急性HBV感染者病毒清除反应与多克隆、多特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞应答有关，HBV自限性感染者大多表现出显著的特异性T细胞反应。通过对急性自限性感染者研究发现，CD4+T细胞针对核衣壳抗原发生强烈的增殖反应，但对病毒包膜抗原很少发生应答。在发生血清学转化的患者，CD4+T细胞以及细胞因子产物对HBcAg和HBeAg的应答最为强烈，这可能是导致病毒清除以及肝病缓解的原因之一。除了具有直接的效应因子的功能，抗原特异性CD4+T细胞对病毒特异性CD8+T细胞的活化也是必不可少的。通过残余的病毒抗原诱导HBV特异的记忆性T细胞表达，对HBV感染的长期控制有重要作用。某些HLA-Ⅱ类等位基因型表达也影响HBV感染的结局，HLA DRB1*1301-01和HLA DRB1*1301-02等位基因表达可上调APC对病毒抗原的递呈能力，抑制病毒增殖。在急性感染恢复期，外周血与肝脏HBV特异性T细胞迅速减少，但在病毒抗原存在时机体仍保持高水平的T细胞反应。

通过测定病毒感染相关抗原的增殖以及胞内细胞因子的表达，表明强烈的、多特异性的CD4+T细胞应答与病毒清除相关；在慢性HBV感染者中，CD4+T细胞增殖以及细胞因子表达常常不能被测出。有研究指出，肝内Th1细胞和Th2细胞的比例是决定HBV感染是否慢性化的主要原因之一。当特异性Th1细胞在肝内占优势时，使CTL细胞清除病毒的功能增强，但同时也加重了肝脏的损伤；当特异性Th2细胞在肝内占优势时，抑制细胞免疫发生，减小肝脏损伤，导致感染慢性化。通过对转基因鼠研究发现，HBeAg主要诱导Th2细胞产生和活化，抑制Th1细胞因子对病毒的清除。Webster等对4位最终完全清除了体内HBV的急性感染者进行研究，发现只有1位患者体内存在HBcAg特异性的CD4+T细胞，但未发现HBsAg特异性CD4+T细胞，这提示CD4+T细胞在抗HBV感染中的作用可能不如在抗HCV感染中强。

二、CD8+T细胞应答

CD8+T细胞在控制HBV、HCV感染中的具有核心作用。在病毒感染过程中，CD8+T细胞最先产生反应，其主要针对病毒抗原肽与MHC-Ⅰ类分子形成的复合物产生应答。CD8+T细胞激活增殖的结果对病毒感染以及特异性免疫反应具有重要意义。同时也应该看到，病毒特异性CD8+T细胞效应是一把双刃剑,它们在控制和清除病毒的同时，可通过穿孔蛋白介导的细胞毒反应以及Fas /Fas受体介导的靶细胞调亡机制引起肝组织的持续性损伤。然而，目前研究表明，非病毒特异性CD8+T淋巴细胞在肝脏损伤中起主要作用。近年来的研究发现，IFN -γ、TN F-α介导的非溶胞机制在病毒清除中也扮演重要角色。

（一）HCV

急性HCV感染时，活跃的CD8+T细胞应答对抑制HCV持续性感染是必需的。在对黑猩猩的研究中发现，当使用抗体封闭动物体内CD8+T细胞功能后，即使动物体内已存在经病毒抗原预处理的Th细胞，感染动物体内病毒呈持续复制状态，直到肝内病毒特异性CD8+T细胞恢复功能后病毒复制才被抑制。在CD4+T细胞的协同作用下，当分泌IFN-γ的病毒特异性CD8+T细胞进入肝内后，发生病毒清除反应。通过细胞内IFN-γ染色发现，病毒特异性CD8+T细胞仅少量或短暂增加的感染者不能清除病毒。经ELISPOT测定病毒特异性CD8+T细胞的IFN-γ表达结果进一步表明，自限性感染者体内CD8+T细胞出现频率显著高于慢性感染者。体外试验表明，在HCV抗原肽刺激下，12名自限性感染者中有11名出现明显的CTL应答，但6名慢性感染者中仅1名出现明显的CTL应答。发生病毒清除反应的患者体内表达活跃的CD4+T细胞和CD8+T细胞，不同的病毒特异性CD8+T亚群分别介导免疫病理过程和病毒清除反应，在细胞毒机制和非溶胞机制的共同作用下控制HCV感染。有研究发现，HCV急性感染时病毒特异性CD8+T细胞的增殖能力、CTL活性、分泌IFN-γ和穿孔素蛋白等功能削弱；当感染者CD8+T细胞功能全面提高后发展成自限性感染，而功能未改善的感染者则发展成慢性感染。

在HCV慢性患者中，四聚体阳性病毒特异性CD8+T细胞占总CD8+T细胞的比例约为0.01～1%，不足以清除病毒；此外，血清低滴度HCV RNA患者体内的CTL反应比血清高滴度HCV RNA患者要活跃。慢性患者中四聚体阳性HCV特异性CD8+T细胞在增殖能力、CTL活性、分泌IFN-γ和穿孔素蛋白等方面功能下降。有报道指出，随着病毒被清除，四聚体阳性T细胞分泌IFN-γ会出现短暂的中止；然而，也有研究者指出，不论病毒完全清除与否，四聚体阳性T细胞分泌IFN-γ和IFN-α功能将会持续下降。这些研究均提示HCV特异性CD8+T细胞功能减弱可能是导致HCV容易慢性化的原因之一。CD8+T细胞识别的特异表位突变可能是导致HCV慢性感染的又一原因。NS3 1073-81是急性HCV感染CD8+T细胞的共识别表位，但慢性患者中CD8+T细胞对此表位的应答率很低，进一步研究发现此表位突变是导致低应答的原因。值得注意的是，目前关于HCV清除的免疫应答研究在特异性和广度方面都远远不足；特别是对那些不但影响免疫应答效率和范围，而且影响免疫逃避突变频率的表位仍需深入研究。慢性HCV感染的潜在细胞免疫缺陷见表2。

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表2      慢性HCV感染的潜在细胞免疫缺陷

免疫细胞亚群	异  常	原     因
CD8+ T细胞	细胞增殖 细胞因子生成 细胞毒作用	？
NK细胞	细胞增殖 细胞因子生成 细胞毒作用	HCV E2与CD81间的作用？
DC	自身刺激、成熟	HCV E1/E2与DC-SIGN/DC-SIGN间的作用

（二）HBV

   HBV急性感染者体内诱发针对HBV的强烈的多克隆、多特异性细胞免疫应答是病毒被清除的关键因素。急性自限性感染者针对HBsAg 和 HBcAg常表现出强烈的多克隆、多特异性CD8+T细胞应答。动物实验发现，CD8+T细胞缺失的黑猩猩接种HBV后呈持续感染状态，直到CD8+T细胞降至正常水平后感染才被控制；对感染HBV的转基因小鼠输入特异性CD8+T细胞后，小鼠肝细胞中的HBV转录下降。急性感染恢复期特异性CD8+T细胞频率下降，但一直保持可检测出的水平，且在很长时间内仍可以维持强烈的、多特异性的CTL应答。有研究表明急性HBV、HCV感染者外周血四聚体阳性CD8+T细胞表型相同，即表达CCR7—CD45RA—（效应-记忆细胞亚群）或CD28+CD45RA—（记忆细胞亚群）；虽然两组表型相同，但CD8+T细胞功能却有明显差异。HBV感染组特异性CD8+T细胞在表现出强烈的细胞毒活性和IFN-γ分泌能力，且胞内含有较多的穿孔素蛋白，在抗原肽的刺激下很容易增殖；而HCV感染组特异性CD8+ T细胞上述功能减弱，可能是HCV更容易出现慢性感染的原因之一。

与HCV慢性感染不同的是，大多数HBV慢性感染者病毒特异性CTL应答缺失或较弱。通过T细胞胞内IFN-α和IFN-γ染色发现，已清除病毒的患者比慢性感染者在CD8+T细胞应答方面更为活跃。血清HBV DNA呈低水平复制的慢性感染者，其外周血单核细胞中四聚体阳性CD8+T细胞可以被测出，而血清HBV DNA呈低高平复制的慢性感染者则不能被测出。长期以来，CTL介导的细胞毒机制被认为是病毒清除的主要原因。然而，近年来的研究认为，CTL分泌的IFN -γ、TN F-α可通过非溶胞途径清除肝内的病毒复中间产物。研究表明，激活的CD8+T细胞可通过配体-受体和细胞内凋亡信号传递, 诱导T细胞自身凋亡，发生“免疫耗竭”；或在高浓度的包膜抗原作用下处于麻痹状态, 导致感染慢性化。此外，肾、胰腺、睾丸等免疫盲区病毒持续释放；免疫耐受现象的发生；Th1/Th2细胞比例失衡；HLA 复合体等位基因多态、细胞因子及其受体基因变异等一系列原因均可导致病毒感染慢性化。总之，HBV和HCV感染慢性化不是单因素作用的结果，在不同的患者或同一患者在疾病的不同阶段各因素的侧重点可能不同。

急、慢性乙型肝炎患者的CTL特点可概括为：

1. 急性乙型肝炎   ①CTL应答是强烈多克隆性，针对多个抗原位点；②HLA-Ⅰ类分子的识别位点众多。

2. 慢性乙型肝炎  ①病毒抗原特异性的CTL应答很弱，呈单特异性或寡特异性；②受染的肝细胞HLA-Ⅰ分子的表达低下。

3. 急性HBV感染后疾病转归的决定因素  ①与HBV抗原肽结合的亲和力；②MHC结合位点的多态性；③T细胞受体库的差异。

三、 细胞免疫与其他免疫的关系

急、慢性HBV感染的免疫应答过程见图2。

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图2、急、慢性HBV感染的免疫应答系统

四、病毒性肝炎慢性化的防治策略

慢性乙型肝炎的通用及潜在治疗策略见图3。

图3    慢性乙型肝炎的通用及潜在治疗策略

五、结语

机体的病毒清除过程十分复杂，从病毒结合细胞表面受体开始，整个机体的组织细胞－免疫网络－效应细胞－效应分子等成分，就进入了一个整体信号协同的过程。随着MHC-表位肽四聚体技术、胞内细胞因子染色以及酶联免疫斑点（ELISPOT）等技术与新的分子生物学方法相结合，HBV和HCV感染中T细胞免疫作用机制的研究取得了很大进步。然而，目前关于病毒特异性T细胞应答过程中一些关键的步骤仍然知之甚少，比如病毒感染后不同阶段T细胞所具有的不同免疫学特征、抗原特异性T细胞如何克隆扩增和分化、病毒特异性T细胞如何向肝内迁移、慢性感染时T细胞功能受到抑制的原因以及病毒性肝炎慢性化过程中细胞免疫与其他免疫的关系等这些关键问题均有待进一步阐明。因此，病毒性肝炎慢性化的防治策略，不外乎病毒和宿主两个方面。其中，宿主免疫无疑将起最根本和关键的作用。

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