中科院乙肝rcccDNA生产技术有望助力抗cccDNA药物研发

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齐欢畅2

中科院乙肝rcccDNA生产技术有望助力抗cccDNA药物研发

来源：艾兰博曼医学网 作者：会飞的喵星人 时间：2016/05/15

中科院深圳先进技术研究院科研人员近日在 Scientific RepoRts  杂志上发表了一篇利用便捷技术在常规实验室环境下大量“生产”乙肝cccDNA（重组cccDNA、rcccDNA）的研究报道，研究结果显示，他们“生产”的乙肝重组cccDNA在结构和功能上非常接近野生型乙肝cccDNA，而这一技术的应用有望助力于对乙肝cccDNA的生物学研究及抗cccDNA药物的研发。

根据世界卫生组织（WHO）报道，全球大约3.5亿至4亿人罹患慢性HBV感染，在亚洲和非洲发病率尤其高。他们面临着形成肝硬化或甚至肝癌的高风险。尽管现有的抗病毒药物可以控制乙型肝炎病毒，但却不能完全清除它。乙肝病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）是HBV复制的模板。其在肝细胞核内持续、稳定的存在被认为是HBV感染慢性化及抗病毒治疗停止后极易复发的最重要因素。有学者根据阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎患者1年后细胞内cccDNA含量的变化，推算出完全清除细胞内cccDNA大约需要14.5年。但这一结论并非来自可靠的数学模型。因此，彻底清除残余的cccDNA是治愈慢乙肝的关键。

然而，目前缺乏生产大量cccDNA的便捷技术来对残余的cccDNA进行研究，在该项研究中，研究人员利用了一种基于微环技术的工具在常规实验室环境中生产出了毫克级别的重组 cccDNA (rcccDNA) 。并且为了验证其功能跟野生型 cccDNA 的差异，研究人员还运用了近期非常热门的基因编辑技术 CRISPR/Cas9 在体外环境中介导裂解rcccDNA  作为其应用的例子。

研究人员先是使用微环技术在常规实验室中生产出rcccDNA，而后在树鼩模型中对 rcccDNA 的功能跟野生型cccDNA（来源于感染HBV的人血清）进行功能上验证。21只未感染HBV病毒的树鼩被随机分成3组：rcccDNA组11只，空白对照组5只，人类HBV组5只。分别在接种后第4、9、15和28天收集树鼩血液标本进行血清HBV标志物的检测，HBV标志物包括HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb 和 HBV DNA 。同时也在接种后的第9天收集树鼩的肝组织标本进行免疫组化分析。

结果显示，接种rcccDNA的11只树鼩有7只被诊断为HBV感染，尤其是在接种rcccDNA后第4天便在这些感染HBV的树鼩血清中检测出了HBsAg、HBcAb 和 HBV DNA，而在接种后第15天出现了HBsAb。而在整个实验过程中均为检测出HBeAg 和 HBeAb。在接种后的15天内HBsAg 和 HBV DNA均从这些感染了HBV的树鼩血清中消失，而HBsAb 和 HBcAb 在实验结束后（接种后的第28天）仍为阳性，这些结果提示树鼩在建立急性感染后便出现自发性的HBV清除。在5只接种了人HBV病毒血液的树鼩中也观察到了相类似的感染——恢复过程，唯一的区别是该组中 HBeAg 或 HBeAb 在接种后瞬间便能在血清中检测出。有趣的是，使用实时PCR技术和便捷PCR技术显示rcccDNA在接种的28天后仍在感染HBV的树鼩肝组织中检测出来，而此时所有的其他标志物几乎都已经消失。这也从侧面反映了在停用抗病毒药物、使用免疫抑制剂或癌症化疗后病毒会重新复发及肝脏炎症重新产生的原因所在，即只要还有微量的cccDNA存在于肝细胞核内，在条件允许的情况下它就会重新生成大量的HBV。



免疫组化结果显示，接种了rcccDNA的树鼩肝组织中HBcAg阳性肝细胞被染成散发性的黄褐色颗粒（图a，左）；而空白对照组HBcAg 为阴性（图a右）。意想不到的是，相较于生物学和组织学上发现了病毒标志物阳性，可在rcccDNA组树鼩组织学水平却并没有发现肝损伤存在（图b）。

研究人员还使用了 Crispr/Cas9 系统进行 cccDNA 清除研究，相关研究结果可参看研究原文。

“我们已经开发了一种基于微环技术的手段来大量生产乙肝cccDNA,在常规分子生物学实验室环境中。且该重组cccDNA无论在结构还是功能上均跟野生型cccDNA接近：能够表达所有病毒RNAs和蛋白，且rcccDNA驱动的病毒还能使树鼩感染、在肝组织和循环血液中生产出病毒，能够被PCR、ELISA和免疫组化等检测出来，而唯一跟野生型cccDNA 不同的是，重组cccDNA 在前C/C基因区上游额外的携带了36-bp DNA 重组产品 attR 。”研究人员在文末中写道。“我们也殷切的希望基于微环技术生产出来的rcccDNA可以用于代替HBVcccDNA用于生物学研究包括在制造HBV感染小鼠模型及抗cccDNA药物研发领域的应用。”

齐欢畅2

我感觉520出来后，搅动了乙肝技术市场，各种技术好像一下子都成熟了。其实是以前有点藏着掖着，现在都在赶工，能发表一点是一点。毕竟时间不多了。其实一旦宣布攻克，很多基础，半基础的，甚至临床的研究全部打水漂。

齐欢畅2

这就是科研的残酷之处，原创第一，就像我们知道阿姆斯特朗第一个登上月球，但第二个呢，和阿姆斯特朗一样付出了心血，但鬼才知道他叫什么名字。

newchinabok

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正能量，欢畅绝对是正能量

齐欢畅2

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哈哈，你为什么总能看到正能量，说明你自己在寻找正能量。很好，你已经觉悟了。哈哈。其实我修为很久了。

hao2014

正能量让人飘飘欲仙 欲罢不能

csfluke

还是国外的竞争环境好，才有520的出现啊，大公司其实很多时候不思进取的

默然10

二战时期就能人造病毒了？！别瞎听瞎传。
当你听到一个消息后记得保持怀疑谨慎的态度，然后自己百度下这条信息的相关情况。你就会自己甄别这条消息选择是否相信。