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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)属嗜肝DNA病毒科成员,是导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌的重要病因,HBV慢性感染者众,终末期肝病治疗难度大,死亡率高,迄今为止,人们对其发病机制还不是十分清楚。虽然在理论上讲,针对乙肝感染理想的免疫治疗策略应该是能诱导并增强肝内先天性和获得性免疫应答,同时应避免诱导肝脏损伤,但一直以来,人们对先天性免疫的研究、应用还不充分,免疫系统固有的抗病毒成员一直都很难检测,而且存活的病毒已经对它们产生适应性或者是抗性[1]。
人类A3G是一种胞苷脱氨酶,是机体固有免疫反应的新成员,具有非特异性的细胞内抗逆转录病毒的保护作用。人们在研究HIV的过程中发现了A3G具有较强的抗逆转录病毒的能力,引起了学者对病毒学领域固有免疫防御机制的新认识及重视。
1 APOBEC分子家族的成员
APOBEC是载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白(apolipoprotein B mRNA-editing catalytic polypeptide)的缩写,是命名脊椎动物拥有胞苷脱氨酶特征性基序His-X-Glu-X23-28-Pro-Cys-X2-4-Cys (X代表任意氨基酸)蛋白的前缀[2]。APOBEC基因家族是一个很大的胞苷脱氨酶家族。成员包括APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A~G以及AID(活化诱导脱氨酶)等。它们通过RNA编辑、DNA编辑及非编辑途径[3]的机制与底物相互作用。APOBEC1是载脂蛋白B mRNA编辑酶,是最早发现的APOBEC家族成员。
APOBEC3家族成员,主要表达于淋巴细胞和骨髓细胞谱系,A3A~G以串联重复形式排列于第22号染色体,A3G基因含有8个外显子和7个内含子,cDNA长度1 155 bp,编码384个氨基酸,其中第128~194位和第320~380位氨基酸残基为两个重要的活性功能区:锌离子结合功能区和水解酶功能区。A3G具有广谱抗逆转录病毒[4]及嗜肝病毒功能,它可使HIV-1 反转录产生的cDNA负链dC脱氨基生成dU,进而互补正链出现G→A超突变;体外实验中,A3G可降低鼠白血病病毒(MLV)感染性[5];对HBV复制有明显的抑制作用;除A3G外,A3B、A3F等均有很强的抗逆转录病毒活性[4];A3F基因全长为13 124 kb,有7个外显子, mRNA为2 629 bp。
免疫共沉淀实验提示A3F和A3G有可能协同表达[2],且在启动子序列具有高度相似性,都具有DNA编辑功能,所以有可能在体内一起行使抗病毒功能。但是,A3G主要引起GG→GA突变,然而A3F主要引起GA→AA突变 。在HBV感染这种GA→AA的突变率是比较高的。A3F 也能抵抗HIV-1的Vif,患者体内逆转录病毒DNA 测序发现GA→AA超突变比GG→AG更常见[5]。
2 APOBEC3家族对人类免疫缺陷病毒(HIV)的抑制作用
HIV中存在vif基因,编码一种病毒感染因子(viral infectivity factor,Vif),反转录病毒科中的大部分慢病毒都含有Vif,Vif是HIV-1感染所必须的。而A3G是一个机体内源性抵抗HIV复制的人类蛋白,它将自身整合进病毒粒子损害病毒遗传物质,Vif是在病毒复制中拮抗A3G的调节蛋白,是病毒入侵机体细胞的武器之一。人们很早就发现Vif,而A3G的发现才真正从分子水平对HIV-1 Vif的功能研究开启了大门。
Vif通过拮抗A3G,可以使HIV-1毒粒的感染力增强10~1 000倍,它含有两个重要的结构域,N端与A3G结合抑制其整合进入病毒颗粒,C端通过泛素-蛋白酶体途径,降解A3G使其从感染细胞内消除[6-7]。两功能结构域内部发生任何位点的氨基酸残基改变均可阻碍其对A3G的降解[3]。
非允许性细胞(nonpermissive cell)是指vif缺失的HIV-1毒株(即Δvif HIV-1)在一些细胞系中不能顺利地复制,这些细胞被称作非允许性细胞;而支持Δvif HIV-1复制的其他细胞系则被称作允许性细胞(permissive cell)[8]。2002年, Sheehy[9]等对HIV进行允许细胞和非允许细胞基因差异表达分析过程中,发现非允许性细胞中存在一种特异的细胞因子,后来发现就是A3G。A3G仅在非允许性细胞中表达,而允许细胞中很少或没有,允许性细胞过表达A3G,可变成非允许性细胞。这些研究提示A3G是决定非允许性细胞表型的必要和充分条件。
Vif和A3G两者相互作用的机制:含有Vif的HIV-1病毒株在非允许细胞内可以顺利地进行复制,提示Vif对A3G酶的功能具有拮抗作用。进一步的深入研究其机制如下:(1)Vif通过与A3G功能区域结合,阻止A3G进入病毒体内; (2)Vif下调A3G基因表达,减少了A3G蛋白的产生[10];(3)Vif 促使A3G泛素化导致其被蛋白酶迅速降解[7,11]。
Vif和A3G之间的上述作用就是一个很好的范例,说明逆转录病毒通过一系列机制躲避宿主的固有免疫的防御,与宿主之间进行生存的抗衡、斗争。从发病机制上看,对不同亚型HIV的易感性、HIV感染者体内病毒的变异情况及病程进展可能是机体A3G不同水平的表达和HIV Vif蛋白斗争平衡的结果。从临床进展上看[12]:人的A3G mRNA水平和HIV病毒载量之间呈显著的负性相关,而A3G mRNA与CD4 + T细胞数之间呈显著正相关,且A3G mRNA量的多少依次为:长期不进展者(LTNPs)>HIV未感染组>疾病进展组,由此推断提高A3G基因的表达可以增强抗HIV感染疾病进展的效应,通过降低病毒载量、提高CD4+T细胞数量及提高A3G水平可以在LTNP减慢病毒进展,减弱甚至阻止病毒血症的发展中起到一定作用。
3 APOBEC3蛋白酶家族对乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用
哺乳动物胞苷脱氨酶APOBEC3蛋白酶家族的成员,均被证实对逆转录病毒具有非特异性的抗病毒作用,同时对乙肝病毒及相关嗜肝DNA病毒的复制也有抑制作用。A3G是在HIV研究中发现的[9],它不仅对HIV有抑制作用,对其他逆转录病毒及对哺乳动物乙型肝炎病毒(HBV)以及禽类鸭乙型肝炎病毒(DHBV)[13]的复制也有影响。HBV和DHBV为DNA病毒, 但其复制首先需要逆转录形成cDNA,这与HIV等逆转录病毒相似,而且HBV的野生株也存在很多位点的G→A突变[14],因此从HBV复制环节上来看,A3G可能也具有潜在的抗HBV的作用。事实上的确如此,A3G具有抗HBV和DHBV的作用,自从Turelli等[15]在2004年的《Science》杂志上发表A3G具有抗HBV作用的文献,一石激起千层浪,APOBEC3家族(主要是A3G、A3F和A3B)的抗逆转录病毒作用就成为目前抗病毒(HIV和HBV)研究的一个热点,但是A3G抑制乙型肝炎病毒复制的机制还不完全清楚,不同学者的研究结果不尽相同。
2004年《Science》杂志连续发表多篇A3G抗HBV作用的报道:Turelli等首次证实了A3G对HBV具有强烈抑制作用,在Huh7肝癌细胞系共转染HBV与A3G真核表达载体,发现A3G能够使培养上清HBV DNA拷贝数明显降低,同时也能降低细胞内核相关的HBV DNA的量,由此推断新生的HBV DNA可能会是A3G转氨基作用的靶标,但是出乎意外的是:在共转染A3G的Huh7细胞内的核相关HBV序列中没有检测到明显的G→A的超突变。进一步的实验显示:催化区失活的A3G突变体不再抑制Δvif HIV-1,但对HBV的抑制作用却保持在野生型的水平,这说明A3G抑制HBV的机制与抑制HIV等逆转录病毒不同,或者转氨基作用是非主要机制,也可能这种机制受细胞内环境及病毒株的限制。由于前基因组RNA(pgRNA)水平降低,而且免疫共沉淀实验发现:A3G在胞浆中可与核心蛋白相互作用,推测A3G是通过阻止HBV核心蛋白对pgRNA的包装来抑制HBV的复制[15]。
随后Rosler[16]等不仅以Huh7细胞作为研究对象,同时发现了A3G在共转染细胞系HepG2中也能显著抑制HBV DNA的复制。他们对共计430例HBV克隆测序发现, Huh7 细胞内的乙肝病毒基因突变很少,且与是否转染A3G无关,但在表达A3G的HepG2细胞内,发生G→A超突变的克隆数较其它类型碱基突变克隆数明显增加,他认为在这两种细胞系的不同结果体现了A3G对HBV编辑作用的细胞依赖性。
Turelli等[17]随后对Rosler 等的假说又做出了回应,他认为在HepG2细胞内,A3G对HBV影响效率较低,所以负链DNA能偶尔合成,这样DNA就能作A3G编辑调节的对象,而在Huh7细胞内,脱氨酶能完全阻止DNA的合成,使其作用底物丧失。
Suspene等应用一种新的PCR——3D-PCR方法(Differential DNA Denaturation PCR) 研究HBV基因组,该方法能够选择性对超突变的序列进行扩增[18],结果发现APOBEC3家族4种脱氨酶(A3G、A3B、A3C、A3F)均能导致HBV负链DNA脱氨基,其中3种(A3G、A3B、A3F)甚至还能导致HBV正链DNA脱氨基。
Nguyen[19]等进一步研究发现A3G对病毒形成的早期环节,包括RNA和蛋白质的合成、pgRNA与核心蛋白的结合、病毒核心蛋白的装配,核衣壳中进行的逆转录合成无明显的抑制,然而A3G和A3F可能通过抑制pgDNA的壳体化、诱导核酸酶降解pgDNA抑制HBV核衣壳的形成,从而达到抑制HBV复制的作用。他们证明了APOBEC3蛋白对乙肝病毒复制的抑制主要是在基因水平,对病毒核酸的包装只有轻微影响。A3G抗乙肝病毒的效应不是通过DNA编辑及HBV DNA降解的途径实现的。A3G的非编辑酶依赖抗病毒效应的底物不仅可以是DNA-RNA杂交体还可以是单链DNA。而且与较短的负链DNA相比,A3G可以优先减少较长的负链DNA的数量,显示出A3G在非常早期的阶段即发挥其抑制病毒逆转录的效应。
不同学者的不同结果是否也提示在不同细胞的内环境中是否存在协同APOBEC3蛋白家族作用的因子或者拮抗APOBEC3的因子,导致其作用具有细胞依赖性?Rosler[13]发现增加或减少X蛋白的表达对A3G抗病毒活性并没有影响,提示X蛋白与HIV的vif蛋白没有相似的功能。不均一核糖核蛋白K(hnRNP K),是一种促进HBV表达的正性调节因子,已被证明是A3B蛋白的主要作用因子。Zhang[20]等研究提示A3B可以抑制hnRNPK与HBV增强子Ⅱ(Enh Ⅱ)的结合以及HBVs基因的转录,A3B可以直接抑制HBV增强子的活性。
因此,APOBEC3G抗HBV可能是在多种机制的综合作用下进行的,APOBEC3G可能在基因超突变、病毒脱衣壳、HBV RNA的逆转录、HBV DNA的复制、HBV DNA的核壳化等多种进程中多方面影响HBV复制。
4 APOBEC3蛋白酶家族与细胞因子的关系
在急性HBV感染中非溶细胞机制是病毒清除的主要机制,虽然有可能在正常情况下,肝细胞不能表达A3G[21],但在急性感染中,在细胞因子的影响下,有可能诱导产生APOBEC3,使其参与非溶细胞病变的病毒清除[17]。由此人们试图了解细胞因子与APOBEC3蛋白家族是否存在联系。
无论是在感染的急性期还是作为慢性期的一种治疗药物,IFN作为内源性的细胞因子在控制HBV中均起了主要作用,然而到目前为止IFNs抑制HBV复制的机制仍然不清楚。近来很多学者发现IFN可以诱导APOBEC3表达升高,并推测A3G参与了IFN-γ和TNF-α抗病毒作用[22-24]。
Bonvin[25]等发现正常人肝脏可以表达A3B、A3C、A3F和A3G的mRNA,而且在原代人肝细胞中IFN-α可以刺激这些脱氨酶,使得其表达水平增长到原来的14倍,A3G、A3F及A3B的mRNA分别可以达到GAPDH mRNA丰度的10%、3%和 3%。
Ying[24]等发现在原代肝细胞、hepG2细胞及巨噬细胞中,IFN均可上调A3F的表达,虽然有学者报道IFN-α不能在hepG2细胞中上调A3F的表达,但他们认为这可能与细胞培养条件及IFN-α的来源以及A3F的定量不同有关。但是需要注意的是,在T淋巴细胞中虽然IFN-α的信号转导途径被活化,可以检测到其他的IFN刺激基因PKR等,但是IFN-α并没有诱导A3F和A3G在这些细胞中表达,这说明IFN-α对A3G和A3F的诱导表达具有细胞依赖性。而且在众多细胞中对A3G和A3F的研究说明IFN-α对这两者的诱导表达是被协同调节的。
A3G和A3F现在被归类到已知的如PKR,ISG15和MX1干扰素刺激基因中,巨噬细胞以及肝细胞是慢病毒及HBV各自的主要靶标,可以通过干扰素上调A3F促使机体肝细胞对HBV及巨噬细胞对慢病毒的固有免疫防御[24]。Ⅰ型和Ⅱ型IFN作用于人肝细胞可以诱导A3G的产生,也可以诱导A3F和A3B的少量产生,然而通过RNA干扰阻断A3B,A3F和A3G,并不会抑制IFNs抗HBV的效应。由此说明,这些胞苷脱氨酶并不是IFN抗HBV时发挥作用的必需因子[26]。
因此,IFN-α可以上调A3G等的表达,它们有可能介导对HBV非溶细胞机制的清除,个体A3G和A3F调节和表达的变化有可能影响乙肝的临床结局。
5 结语
APOBEC3作为机体内源性的天然抗病毒因子,参与宿主抵抗病毒入侵的固有免疫防御机制,为机体先天性免疫机制的研究开拓了新的方向, HBV严重威胁人类生命健康,目前尚无完全控制和清除HBV感染的有效治疗手段。一直以来,人们更多的将目光投向机体的特异性免疫应答,如何提高机体自身免疫力和抗病毒能力,开发针对病毒不同生活周期、抑制细胞复制的新型药物, 是目前治疗HBV感染的研究重点和发展方向,也有可能对其他病毒性疾病的防治提供新的线索并产生重要的影响。 |
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