乙型肝炎病毒核苷类似物耐药性监测及临床意义（转）-->可可转移

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来源 http://www.medonline.com.cn/doctor/meeting/gbxh0912/ztbg11a.htm 乙型肝炎病毒核苷类似物耐药性监测及临床意义 　　　　　　　　　　　　　　　　广州第一军医大学南方医院（510515） 侯金林 孙剑 　　我国是病毒性肝炎高发地区，以乙型病毒性肝炎为例，全国估计有1.3亿慢性HBV感染者，其中有2000万左右是需抗病毒治疗的慢性进展性肝病患者。近年抗病毒药物的发展使有效系统治疗慢性乙型肝炎成为可能。新近发展的核苷类似物（Nucleoside analogues）可抑制HBV复制，是治疗慢性乙型肝炎的一大突破。拉米夫定（LAM）和泛昔洛韦（FCV）是这类核苷类似物的代表性药物，迄今在全球已超过5000例的治疗经验，与对照组相比，治疗可以稳定ALT和改善肝组织学。新的核苷类似物罗布卡韦（Lobucavir）和阿的福韦（Adefovir dipivoxil）已完成了Ⅰ/Ⅱ期临床试验。罗布卡韦三磷酸化物是HBV DNA聚合酶的强抑制剂，但由于毒性反应现已停止了进一步临床验证。最新发现BMS 2000475、FTC、FMAU、Entecavir和Emtricitabine等核苷类似物有良好的抗HBV活性。以上这些核苷类似物仅能阻断HBV逆转过程，停药后复发率高。长期应用易发生耐药，本文就核苷类似物耐药可能带来的一系列问题进行讨论。 　　一、 HBV聚合酶基因结构与核苷类似物耐药 　　1996年在临床应用拉米夫定治疗的病例中首先发现HBV耐药毒株的存在。目前认为HBV核苷类似物耐药与聚合酶基因变异有关。HBV多聚酶基因编码约816个氨基酸的多蛋白，其氨基端为未端蛋白，羧基端为RNA酶H，后者上游紧邻反转录酶/DNA聚合酶。通过计算机模拟分析将HBV聚合酶基因活性部位分为A到E五个区段（图1）。目前已发现的耐药株中P基因变异是多位点的，但相对集中于P基因C区的酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸（YMDD）基序。不同的核苷类似物耐药株的变异位点不一致，LAM耐药株的P基因变异多位于C区，其中以YMDD变异最为常见；而FCV耐药株的P基因变异多位于B区，两者较少重叠（表1）。 图1 乙型肝炎病毒多聚酶基因变异和耐药 　　表1 核苷类似物耐药株中P基因变异 　　 氨基酸位点 原型氨基酸 变异氨基酸 拉米夫定治疗患者 第550位 蛋氨酸 异亮氨酸 蛋氨酸 缬氨酸 第553位 缬氨酸 异亮氨酸 第559位 丝氨酸 苏氨酸 泛昔洛韦治疗患者 第519位 缬氨酸 亮氨酸 第526位 亮氨酸 蛋氨酸 亮氨酸 缬氨酸 第523位 脯氨酸 亮氨酸 第530位 苏氨酸 线氨酸 第518位 甘氨酸 谷氨酸 第520位 甘氨酸 半胱氨酸 　　二、 核苷类似物耐药的检测方法与监测方案 　　临床发现细菌感染进行药敏试验，根据药敏结果选用抗生素已是习以为常工作。然而，临床上如何监控HBV耐药毒株的产生？药敏检测模式如何？等均是我们面临的新课题。借鉴研究人类免疫缺陷病毒（HIV）耐药的经验，国内外在HBV耐药研究方面已经积累了一定的经验。目前二种方法可用于研究HBV耐药，一种用于测定HBV表型耐药（Phenotypic resistance），另一种方法是测定基因耐药（Genotypic resistance），实际应用中表型耐药和基因耐药的测定可互相补充和互相印证，同时参照HBV DNA定量结果进行分析。 　　1、 基因型耐药（Genotypic resistance） 　　即用聚合酶链反应（PCR）方法扩增抗病毒药物作用靶的聚合酶基因，测定序列，分析核苷酸和氨基酸突变情况。采用DNA测序的方法分析HBV耐药，过程繁琐，费时费力，不便于用于临床检测。国内外已先后报道用Line Probe、Real-time PCR和限制性片段长度多态性分析等快速筛检方法检测YMDD突变。我们设计了错配PCR限制性多态性技术同时参照HBV DNA定量结果，监测拉米夫定治疗中YMDD突变株的动力学变化，在内地和香港地区4家医院应用取得满意的结果。 　　2、 HBV表型耐药（Phenotypic resistance） 　　克隆感染个例体内HBV全基因，或通过定向突变技术在野株中引入特定的突变位点，在体外转染细胞系，HBV对药物的敏感性，如克隆的毒株对药物的敏感性不到野株的1/4，可确定为表型耐药。这一方法繁杂，目前无法进行推广应用，只限于国内外少数几家医院进行研究之用。结合我国实际情况，我们认为，对于核苷似类物治疗过程中发生频率高的单一突变，如该突变体已发现与耐药有关，如HBV P基因YMDD突变，可用错配PCR限制性片段多态性技术与DNA序列分析技术结合技术结合监测其治疗中动力学变化。分子生物学技术快速筛检与DNA序列分析技术结合同时参照HBV DNA定量结果，可能为HBV耐药的临床监测模式之一（图2） 图２　乙型肝炎病毒乃要检测流程 　　3、 抗病毒治疗过程中HBV动力学检测 　　定量检测血清中HBV DNA动态变化，具有重要的临床价值。核苷类似物治疗过程中血清HBV DNA先下降后复升，多提示有耐药的可能。国外不同厂家检测HBV DNA方法比较（表2）。 　　表2 国外不同厂家检测HBV DNA方法比较 生产厂家 检测范围 (雅培)Abbott Solution Hybridization Assay 1.6-800pg/ml (带金)Digene 1st Generation Hybrid Capture Assay 2-2000pg/ml(1.4×106－5.6×108拷贝)/ml Digene 2and Generation Hybrid Capture Assay (Standard test)Ultra-sensitive method 1.4×105－1.7×109拷贝/ml 4.7×103－5.6×107拷贝/ml Chiron QuaritiplexTM bDNA Assay 0.7-5000Meq/ml(7×105－5×109拷贝/ml) (罗氏)Roche AMPLICORTM HBV MonitorTM PCR Assay 1000－1×107拷贝/ml 　　三、 HBV 核苷类似物耐药的临床意义 　　1、 YMDD突变后HBV DNA反跳是否引起肝炎活动？是免疫还是病毒直接损伤？ 　　一般认为YMDD突变后HBV DAN反跳引起肝炎活动。YMDD变异株在转染细胞系中的复制活性低于野毒株，然而对LAM敏感性降低1000~10000倍。临床上，随着血清YMDD突变株的出现，HBV DNA可重新回升，部分病人出现肝炎急性发作，甚至肝功能失代偿。 　　我国台湾地区对55例LAM治疗的慢性乙型肝炎病例进行研究，平均疗程104周，结果发现治疗2年后55%（32/55）病例发生YMDD突变；有YMDD突变者90%ALT升高；45%出现YMDD24周后伴有肝炎急性发作；24%病例ALT大于10倍正常值以上。3例出现肝功能失代偿。 　　在广州南方医院接受LAM治疗的70例慢性乙型肝炎患者，其中男性45例，女性25例，年龄从18-64岁，用药时间从9个月-24个月不等，对每例病人均定期收集其系列血清标本。发现11例出现YMDD变异其中YMDD变异6例，YVDD变异5例，后得有3例合并有L526M突变。出现耐药突变株后，所有患者均出现HBV DNA定量反跳，半数上以的病人同时有转氨酶的反跳，这些病例均在密切了随访中。 　　在此基础上我们进一步与山东省传染病院合作，对他们从1997年12月到2000年4月1日服用LAM 半年以上的病例有192例进行了分析，疗程为26WQ-121W，平均49W；剂量为体重≥70kg者150mg/d，体重＜70kg者10mg/d；其中27例在治疗过程出现HBV-DNA复升，HBV-DNA复升为治疗后的28W-11W。对复发病例随机检测11例，检出YMDD变异7例。7例检出病例除有1例ALT正常外，其他病例均有不同程度升高，平均316（17-1760）U/L，其中1例出现肝功能失代偿死亡。 　　我们在对香港马丽医院送检的68例LAM治疗的病人中，检出YMDD突变10例，均有不同程度的ALT复升，其中1例出现YMDD后发展为重型肝炎死亡。 　　YMDD突变后肝炎活动加重，是由于变异的病毒直接损伤，还是机体对变异病毒的不同免疫应答所致？均有待进一步研究。 　　2、 YMDD突变HBV DNA反跳引起肝炎活动是否与YMDD以外的突变有关？ 　　在台湾对23例出现接受拉米夫定治疗中出现YMDD变异的病例进行了更长时间的治疗随访研究，收集了系列标本，随访结束时7例为A529T突变，6例为L528M/M5501I突变，1例为上述两种突变株的混合感染。通过体外定向突变技术证实A529T突变和L528M/M550I突充均为耐LAM毒株。有18例病人在随访过程中出现了耐药突变株类型的变化（包括M522I、L526M/M552V、混合感染及新出现的耐药突变株等），其中15例出现了肝功能的改变，后者11例ALT水平上升达5倍正常值上限，出现ALT上升的同时多数都伴有HBV DNA定量水平的升高。因此认为体耐药突变株类型的变化引发肝功能和改变和HBV DNA定量的改变，可能是由于机体免疫清除原有突变株的过程所引起。新出现的耐药突变株逐渐转变为优势株，又引发机体的免疫清除，引起肝炎活动。在这种情况下又会出现另一种更新的耐药突变株，如此循环下去。作者认为各种耐药突变株原先就存在于体内，只不过表现为弱毒株，检测不到而已。 　　3、 FCV耐药 　　国内外有关FCV耐药报道不多，Aye等报道了1例肝移植者术后发生HBV感染，应用FCV250-500mg/日，治疗后5个月出现复发，HBV DNA滴度上升，继续治疗2年，无明显效果，P基因测序发现第519位缬氨酸变为亮氨酸（V519L），同时第526位亮氨酸变为蛋氨酸，Locarnini等报道了5例对FCV部分反应和治疗后复发的病人，均在FCV治疗后6~18月时得发，HBV上升，测序时发现HBV P基因YMDD上游B区发生突变。 　　我们的研究表明，FCV联合胸腺肽治疗半年31%患者出现P基因B区变异，变异与HBV DNA反跳呈明显相关性。我们发现FCV耐药株P基因变异位点多位于B区，未发现Aye等报道过的FCV耐药株V519L变异我们在中国病人中发现多种未报告过的突变株，比如在2例病人发现HBV G518E或/和G520C，这一联合突烃可能与耐药有关，有这种变异的病人均随着变异的出现，伴有病毒定量反跳，停用FCV回复突变到野株。在我们的研究中有两例未发生变异的患者也出现HBV DNA反跳，故单纯P基因B区和C区变异并不能完全解释HBV DNA反跳。发生烃异的9例患者中，仅有7例出现HBV DNA反跳，另两例未出现反跳，提示P基因变异并非都与耐药有关，一部分P基因变异可能是自然突变的结果。 　　4、 YMDD突变后是否可用其他抗病毒药物治疗？联合或序贯治疗能否推迟耐药性产生？ 　　核苷类似物需服药一年以上，因此部分病人出现对核苷类似物的耐药不可避免。病人一旦出现核苷类似物耐药，合理观察和处理非常重要。虽然，出现YMDD突充后在多数病人没有导致临床症状加重，但是，在多数病人随着血清YMDD突变株的出现，HBV DNA水平反跳，ALT复升且渐趋向于治疗前的基线值。病人出现耐药，在无其它更为经济有效的抗病毒方案选择时，可在严密观察下继续用药。如出现ALT增高，临床症状加重，则应停药，改用重组干扰素或FCV（不伴有L526M突变时）治疗。阿的福韦对YMDD突变株和L526M突变均有效，因此将来上市后有可能作为治疗这两种耐药突变株的有效药物。 　　5、 核苷类似物无应答是否与突变有关？ 　　已有报告对LAM和FCV无应答的乙型肝炎病例，是否与病毒因素有关目前尚不清楚。 　　四、 加强核苷类似物耐测的规范和管理 　　随着近期多种抗HBV核苷类似物的临床应用，如何监控HBV核苷类似物耐药性的产生以减少医疗经济损失，如何组织和发展核苷类似物HBV耐药性监测计划，并指导各级医院和国家的抗HBV药物管理。这些问题已成为临床医师关注的焦点，研究HBV耐药性对治疗效果的影响可能有重要的临床价值。 　　国产FCV和进口LAM的相继上市，将为我们提供新的抗HBV药物选择。然而，我们必须高度重视这些药物的耐药性，应尽早出台我国的抗病毒药物使用政策，形成全国各级医院参与的耐药监测网络，并选择几所中心城市大医院成立标准化的病毒耐药监测中心，定期通报HBV耐药研究情况。国内外专业人员（含管理人员）应定期开会讨论耐药研究方面的使用。制定严格的抗病毒药物使用制度，必须有合格专科医师的处方，上级医师对处方的审核，才可开始抗HBV治疗。同时应严格掌握卫生部批准的使用适应症。对于慢性无症状携带者出错阶段不宜盲目急于使用核苷类似物进行抗病毒治疗。 　　在我国，对于HBV等病毒耐药的研究需要临床医师、分子生物学家和病毒学家的密切合作，研制自动化程度高、能快速和准确鉴定病毒耐药的方法。新发展的基因芯片（DNA array）技术的应用可能为病毒基因耐药的监测带来重大进展。 　　结论：到目前为止发现的HBV耐药毒株与聚合酶基因变异有关，大多为低复制毒株；YMDD突变后HBV DNA反跳可引起肝炎活动加重；HBV DNA定量检测与测序和PCR-RFLP可用于监测体内HBV动力学变化；阐明药物诱导HBV突变的确切生物学意义，需将耐药突变体转染培养细胞系，进行体外病毒药敏实验。