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乙肝病毒S基因变异研究进展



第一军医大学南方医院传染病科（广州 510515）



孙剑综述　侯金林 陈金军审校



    摘要　本文对近的来乙肝病毒S基因变异的研究进行综述，在发现S基因第145位氨基酸点突变后，陆续报道了S基因其它部位如第126、131和144位氨基酸等部位的变异。S基因变异可发生于自然感染个体中，也可见于疫苗失败者、HBIG治疗移植后肝脏HBV感染失败者以及HBeAg（一）HBV感染者，最近还报道了由核苷类似物治疗导致的S基因变异，但S基因变异发生的频率及其临床相关性如何还难以确定，这给临床工作者带来一些新问题。



    关健词：乙肝 基因变异 免疫



    乙肝病毒S基因编码HBsAg，HBsAg有重要的生物学意义，是乙肝疫苗的主要成分，是诊断HBV感染的重要依据，抗-HBs可用来预防肝移植后再感染HBV，所有这些都有赖于HBeAg与抗-HBs之间的相互作用，故HBeAg抗原性的变化会影响上述作用。HBVS基因易于变化，可发生于自然感染或医源性干扰过程中，最常见的是第145位氨基酸由甘氨酸突变为精氨酸（G145R）。S基因变异有重要的临床意义，可导致HBV亚型的改变，疫苗免疫失败 、HBIG预防移植后肝脏再感染HBV失败以及HBeAg（一）HBV感染等问题。本文围绕上述问题综述如下。



1 S基因及基编码蛋白的结构与功能



    S基因位于核甘酸（nt）第155-833位，编码226个残基的外膜主蛋白即HBeAg，后者是引起机体产生保护性免疫的主要成分，它有一个免疫优势表示称为“a”决定簇，在所有亚型中均存在。由被动免疫产生的抗体90%是针对“a”决定簇，此种抗体可对所有亚型的HBV感染提供保护性免疫，而其它亚型抗体之间并无交叉免疫。“a”决定簇位于氨基酸（aa）124-147位，是HBV各亚型的共同决定簇，有一定的空间构型。由aa124与137、139与147位之间的半胱氨酸残基经二硫键形成两个环，这两个环在维持HBeAg抗原性方面有重要意义。其中第二个环是优势“a”决定簇所在，aa141-145是抗体结合必须的部位。A肽段高度保守，其中几个、甚至单个氨基酸的改变就有重要的生物学意义，尤其如aa124和147位半胱氨酸被丝氨酸所替代，将破坏构型的稳定性，aa124的脯氨酸被异亮氨酸替代形成的疏水链将代变异就足以改变HBeAg的构型，从而改变其抗原性和免疫原性。Wallace等[1]最近提出S基因的主要亲水区概念（Major Hydrophilic Region,MHR），扩大了以前的“a”决定簇，从aa99-169位，并把MHR分为5个区：HBs1（aa120上游）、HBs2（aa121-123）、HBs3（aa124-137）、HBs4(aa139-147)、HBs5(aa149-169)，S基因变异多数的临床意义有一定相关性，便于解释发现的变异株，同时也利于不同地区S基因变异检测结果的相互比较。



2 S基因变异常见发生部位



    S基因变异多集中在“a”决定簇，其中最常见的是G145R变异。此外，还有一些其他位点变异的报道（见附表）。



附表 S基因变异常见发生部位



位置         原型      替代     变异株感染者     HBs状态



“a”决定簇

　

第124位      半胱氨酸  酪氨酸   肝移植受HBIG     Ag（一）



126位或       苏氨酸   丝、异亮  疫苗接种小儿   Ag和Ab（一）



131位               天冬酰胺  疫苗接种小儿   Ag（一）



133位         蛋氨酸     苏氨酸    疫苗接种小儿   Ag（一）



139位         半胱氨酸   终止密码   携带者        Ag（+）



141位         赖氨酸     公氨酸    疫苗接种小儿   Ag和Ab（+）



145位         甘氨酸     精氨酸    疫苗接种小儿   Ag和Ab（+）



“a”决定簇前插入： aa122-124之间  慢性肝炎   Ag（一）





3 S基因变异与HBV亚型改变



    HBV共有9种不同的亚型，不同的亚型其S基因序列不尽相同，分布与地理位置有关。其产生机制认为是自然感染过程中，在宿主的免疫压力下，S基因发生变异，经过免疫选择的结果。HBV的亚型由HBeAg第122位是赖氨酸或精氨酸决定d/y亚型，160位是赖氨酸或精氨酸决定w/r亚型，这样一共组合成4个主要亚型：adw、adr、ayw和ayr。Okamoto 等[2]报道了两例复合亚型（分别为adwr和adyr）的HBV感染者，经基因克隆后测序发现adr亚型与ayr亚型的核苷酸序列差别在于第365位核苷酸由A变为G，导致第122位氨基酸由赖氨酸变为精氨酸；adw与adr亚型的核苷酸序列差别在于第479位核苷酸由A变为G，导致第160位氨基酸由赖氨酸变为精氨酸。同时Okamoto等[3]还报道了亚型缺失的3名“健康”献血者，发现第480位核苷酸由A或G变为C，第160位氨酸变为天门冬氨酸，则失去w/r亚型：第365位核苷酸由A突变为C，导致第122位氨基酸变为苏氨酸，则失去d/y亚型，除了第122位及160位氨基酸能影响亚型外，他们还发现第144位由天门冬氨酸变为谷氨酸或145位由甘氨酸变为丙氨酸，也可导致d/y亚型缺失。类似的结果Wallace等[4]也报道过，120、143和144位等部位的氨基酸变异也导致亚型改变。尽管亚型变异不影响HBV复制，但由于各亚型抗体之间无交叉免疫，故不同亚型的HBeAg与抗-HBs 可以共存。



4 S基因变异与免疫接种



    国际上普遍推广的乙肝免疫接种可在相当大程度上降低HBV感染率，但尽管经过正规的主动及被动免疫仍出现一些个例感染HBV，其原因之一是出现免疫逃避现象。



    Carman等[5]报道意大利1590例婴儿，其母亲大部分为HBV携带者，出生后在0、1月接受HBIG被动免疫，3、4、9月接受疫苗为主动免疫，其中有44例虽已产生了保护滴度的抗-HBs，但仍感染了HBV，其中1例还发生严重肝炎，测序发现其S基因第587位碱基由G突变为A，导致第145位氨基酸由甘氨酸变为精氨酸，这种变异株较原型毒株有生存优势，在其后的5年随访中均存在，而其母亲体内未见此种变异株存在。Waters等[6]通过体外实验证明了G145R突变株的免疫原性及与原型毒株抗-HBs的结合力均发生明显变化。Ogata等[7]通过动物实验证明了此种变异株对动物有传染性和致病性，同时具有免疫原性。对这一变异株的产生机制目前仍不明，有人认为这种变异株是母亲体内的少数毒株经垂直传播给婴儿后，经免疫选择成为婴儿体内优势株；也有人认为母亲体内无这种突变株，是原型毒株在婴儿体内免疫压力下发生变异的结果。随着疫苗的广泛推广，促使HBV发生变异的免疫压力逐渐增大，变异发生机会增加，幸而G145R突变株表达的HBeAg还能为多数常规诊断试剂所检出，令人担忧的是HBeAg（一）HBV感染问题，将在下面谈到。



    Oon等[8]报道了新加坡HBeAg（+）同时HBeAg（+）母亲所生的345名婴儿，常规应用主动及被动免疫方案，仍有18例感染HBV。自1985年起对他们中的16例感染者及其父母进行随访，其中12例出现第145位甘氨酸变为精氨酸，还有第126、129、133和144位等部位氨基酸的变异。其他作者也有类似报道[9，10]。由于上述疫苗免疫方案与常规疫苗免疫方案有所不同，故有人认为延迟的免疫方案可能与突变发生有关。但随后就有不少报道证明采用0、1、6免疫方案接种同样可导致S基因变异。



5 S基历因变异与HBIG预防移植后肝脏HBV感染



    抗-HBs可对易感者提供保护性免疫，国际上普遍采用HBIG预防移植后肝脏再感染HBV。但近年来发现不少患者经HBIG治疗后仍然感染HBV，经研究发现与HBV S基因变异有关。Carman等[11]报道了8例肝移植患者术后均发生HBV感染，其中5例在HBIG治疗过程中发生HBV感染，测序发现其S基因第20、44、114、130、145、184和188位氨基酸等多处有变异；1例术后未用HBIG治疗和另一例HBIG治疗终止后再感染HBV患者，其S基因未见病异；对照组8例接受肾移植同时是HBV慢性感染者，未用HBIG治疗，只有1例出现S基因变异。Ghany等[12]报道了20例肝移植后用HBIG治疗患者，均重新感染HBV。S基因测序发现其中10例患者出现“a”决定簇变异，HBIG治疗结束后，78%的变异株被移植前的原型株所代替，2例未用HBIG治疗的肝移植患者未出现S基因“a”决定簇变异。他们的结果还发现，HBIG治疗持续时间的长短与S基因变异发生率之间有一定关系。可见HBIG造成的免疫压力促进了S基因变异的发生。 在这种免疫压力消失后，这种变异株会逐渐消失，原型毒株成为优势毒株，因此检测此种状态下发现的变异株，不同时间采样可能获得不同的结果。McMahon等[13]报道了3例肝移植患者体内HBV追踪调查结果，术前术后均用抗-HBs、单克隆抗体治疗，术后HBeAg阴性，但4～9个月后又转阳，分析其S基因序列发现 aa124、129、131、137、140和145等多点变异。Cariani等[14]报道了4例肝移植患者术后用HBIG治疗，均出现HBeAg、抗-HBs共存现象。S基因测序发现第586位核苷酸由C变为A，587和588位核苷酸都由G变为A，导致第145位氨基酸由甘氨酸变为赖氨酸，不同于以往报道的145位由甘氨酸突变为精氨酸。Hawkins等[15]也报道了类似结果。最近有报道在HBIG治疗终止后仍出现HBV S 基因变异，此变异株是否具有生存优势，还有待进一步研究[12]。



6 基因变异与HBeAg（一）HBV感染问题



    HBeAg（一）HBV感染是临床及流行病学的一大难题，影响对HBV感染的诊断，导致临床漏检及献血员筛检错误。Lai等[16]检测了1471例HBeAg（一）献血者，ALT升高者中 HBV DNA阳性率达9%。ALT正常者中HBV DNA阳性率为0.5%，可见HBeAg（一）HBV感染流行相当严峻。HBeAg（一）与诊断试剂的敏感性、HBeAg滴度等有关，此外还与HBV S基因变异有关。侯金林等[17]报道了2例HBeAg（一）HBV DNA （+）慢性肝炎患者，对其S基因测序发现1例在S基因第518位核苷酸酸插入了6个核苷酸，从而在HBeAg密码子第122和123位之间“a”决定簇前多编码了2个氨基酸；另1例于518位核苷酸后插入了9个核苷酸，导致在密码子第123和124位之间“a”决定簇前多编码了3个氨基酸，此种变异导致HBeAg抗原性发生改变，常规酶联免疫所用的抗HBs不能与变异的HBeAg结合，导致HBeAg（一）HBV感染。除了插入变异外，Carman等[18]报道了1例淋巴瘤患者，4年前曾接受过正规疫苗免疫，且产生了保护性抗-HBs，检测HBeAg（一）及HBV DNA（一）。化疗结束时，突然发生暴发性肝炎，但常规检测HBeAg仍为阴性，应用多克隆抗体显示HBeAg阳性，斑点杂交及PCR显示HBV DNA阳性，测序发现S基因第40、49、145、和220位氨基酸均发生变异，而且第122位与123位之间还插入了2个氨基酸。此外，Cariani等[14]报道了由于第587和588位核苷酸同时由G突变为A，导致145位氨基酸由甘氨酸变为赖氨酸，常规诊断试剂检测HBeAg（一）。Lai等[19]报道了1例S基因启动子缺失导致的HBeAg（一）HBV感染。Kremsdorf等[20]研究了一名 HBeAg阴性HBV感染者，PCR检测HBV DNA（+），对其全基因序列检测发现S基因第23位、preS基因144位、149位、150位、preC/C69位、P基因177位、236位、240位、256位、283位、296位、320位和356位等多点变异，并通过细胞转染试验发现P基因变异导致病毒复制水平降低，故认为HBeAg（一）不仅与病毒变异有关，还与病毒复制能力低下，导致蛋白表达水平降低有关。可见引起HBeAg（一）的分子病毒学机制还比较复杂。



7 S基因变异与核苷类似物治疗



    核苷类似物在治疗乙型肝炎方面的疗效已经得到肯定，然而在拉米夫定和泛昔洛韦治疗期间有些病例出现HBV　DNA复高，ALT上升，多数情况下是由于HBV的P基因变异，出现拉米夫定或泛昔洛韦抗药性的结果。HBV/P基因与棋因互相重叠，特别是HBeAg“a”主要决定簇aa99-169 区段部分与P蛋白裂解A和B部位（aa454-524）重叠，任一基因的变异将有可能对S和P两种蛋白序列产生影响。如新近报告的一株拉米夫定抵抗HBV毒株，导致HBeAg“a”主要决定簇aa157由丙氨酸变为天门冬氨酸[21]；另一株泛昔洛韦抵抗HBV毒株，导致HBeAg “a”主要决定簇aa164由谷氨酸变为天门冬氨酸[22]，两种变异均对HBeAg抗原性有影响。



    出现拉米夫定抗药性最常见的原因是多聚酶氨基酸序列酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸（YMDD）突变为YV（缬氨酸）DD或YI（异亮氨酸）DD。最近的一项研究结果发现，口服拉米夫定治疗12个月，结果发现14%的病例出现拉米夫定抗药性，其中YVDD和YIDD突变型各占一半；YMDD区段突变导致S基因aa195由蛋氨酸变为异亮氨酸或色氨酸变为亮氨酸。Aa196由丝氨酸变为色氨酸，此变异对HBeAg抗原性的影响有待进一步研究[23]。拉米夫定和其它核苷类似物的应用与S基因变异的研究将是重要的课题之一。



    小结：S基因变异多在主动或被动免疫压力下发生，变异常见于“a”决定簇尤其是G145R突变。变异导致HBeAg抗原性和免疫原性发生改变，影响HBeAg与抗-HBs之间的相互作用，从而引起一系列的临床问题。对于免疫接种失败问题，目前主张采用包含Pre-S的疫苗或含有G145、R145的疫苗或DNA疫苗；对HBeAg（一）HBV感染问题，可应用PCR或联合应用多种单克隆抗体或单克隆抗体与多克隆抗体联合应用来检测HBeAg；HBIG治疗导致S基因变异问题，目前可采用HBIG联合核苷类似物，也可用能G145R突变株结合的单抗联合HBIG。尽管世界各地有不少报道认为S基因变异与临床有相关性，但其发生频度如何及其临床联系程度如何还有待进一步深入研究。



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校对时间：2000-03-01 李慧利