340例CHB患者HBV耐药突变分析

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340例慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒多位点耐药相关突变分析
来源：国际肝病
作者：徐东平 刘妍 成军 李晓东 戴久发
布时间：2008-12-24

文章导读：目的 分析慢性乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因与核苷（酸）类似物耐药相关的12个位点上的突变情况及其临床意义。 方法 提取血清HBV DNA，扩增HBV逆转录酶基因，对PCR产物进行DNA双向测序，对测序成功的样本进行基因型分析。检测逆转录酶基因12个位点上的碱基突变情况，分析不同核苷（酸）类似物使用情况、患者的耐药相关突变情况及不同核苷（酸）类似物耐药的突变形式。 结论 检测HBV逆转录酶基因多位点耐药相关突变，有助于临床及时发现和确认乙型肝炎患者是否存在HBV耐药，合理进行抗病毒治疗。


【摘要】  目的  分析慢性乙型肝炎患者HBV逆转录酶基因与核苷（酸）类似物耐药相关的12个位点上的突变情况及其临床意义。 方法  提取血清HBV DNA，扩增HBV逆转录酶基因，对PCR产物进行DNA双向测序，对测序成功的样本进行基因型分析。检测逆转录酶基因12个位点上的碱基突变情况，分析不同核苷（酸）类似物使用情况、患者的耐药相关突变情况及不同核苷（酸）类似物耐药的突变形式。 结果  检出拉米夫定耐药突变63例，阿德福韦耐药突变10例，恩替卡韦耐药突变8例，替比夫定耐药突变1例。拉米夫定耐药突变中以M204V和M204I最常见，前者通常伴随L180M突变，后者常单独出现；阿德福韦耐药中以N236T±A181位碱基替换为主；恩替卡韦耐药突变发生在拉米夫定耐药基础上，以T184位碱基替换为主；替比夫定的耐药突变为M204I。少数未接受过核苷（酸）类似物治疗的患者也可检出耐药相关突变。 结论  检测HBV逆转录酶基因多位点耐药相关突变，有助于临床及时发现和确认乙型肝炎患者是否存在HBV耐药，合理进行抗病毒治疗。


【关键词】  肝炎病毒，乙型； 突变； 耐药

Multiple-site analysis of HBV drug-resistant mutations in 340 patients with chronic hepatitis B
XU Dong-ping*, LIU Yan, CHENG Jun, LI Xiao-dong, DAI Jiu-zeng, LI Le, LIANG Zhao-ling, BAI Li, ZHONG Yan-wei, XU Zhi-hui, REN Xiao-qiang, ZHANG Ling-xia. *Viral Hepatitis Research Laboratory, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China

【Abstract】 Objective  To analyze HBV drug-resistant mutations against nucleos(t)ide analogues at 12 reported sites in 340 patients with chronic hepatitis B. Methods  Serum HBV DNA was extracted and a nested PCR assay was employed for the reverse transcriptase (RT) gene amplification. Direct sequencing of PCR product was performed. The significance of detected mutations was analyzed in view of clinical data of the patients. Results  Drug-resistant mutations were detected in 68 patients taking lamivudine (LAM), 10 taking adefovir (ADV), 8 taking entecavir, and 1 taking telbivudine (LdT). M204V and M204I were the most common LAM-resistant mutations. The former usually emerged with L180M while the latter often emerged alone. N236T±A181 substitution was the most frequently seen ADV-resistant mutation. ETV-resistant mutations occurred on the basis of LAM-resistant mutations and T184 change was the most common form. LdT-resistance was observed as M204I. Interestingly, these drug-resistant mutations were detected in a few patients who had not been treated with nucleos(t)ide analogues. Conclusion  Detection of HBV drug-resistant mutations at multiple sites of the viral RT gene is valuable for discovering and verifying drug resistance and thus is very helpful in planning anti-HBV therapy.


【Key words】Hepatitis B virus;  Mutation;  Drug resistance

　　核苷（酸）类似物作用靶点均为HBV聚合酶/逆转录酶（reverse transcriptase，RT），当HBV处于药物选择压力下时可使病毒准种库中带有耐药突变的病毒株得以选择性扩增，或诱发RT基因产生适应性耐药突变。目前临床使用的核苷（酸）类似物有拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定。随着抗HBV核苷（酸）类似物种类的增多和使用时间的延长，仅检测拉米夫定耐药突变YVDD/YIDD（rtM204V/I）已不能满足临床需要。目前已知拉米夫定耐药相关突变还有RT基因区的M204S、L180M、V173L、A181T、Q215S等；阿德福韦耐药相关突变有N236T、A181V/T、V214A、Q215S、L217R、I233V等；恩替卡韦耐药相关突变有S202G/I、M250V/I/L、T184G/A/L/I等，替比夫定耐药相关突变有M204I等[1-7]。此外，新的耐药突变形式还在陆续出现。因此，检测HBV RT基因所有核苷（酸）类似物耐药突变，对临床合理制订抗HBV治疗方案十分重要。我们建立了灵敏特异的PCR产物直接测序法，对340例慢性乙型肝炎患者血清HBV RT基因的上述12个位点的突变进行了检测分析。

　　资料与方法

　　1. 对象：收取2007年在解放军第三○二医院就诊和治疗的慢性乙型肝炎患者血清用于检测。


　　2. HBV RT基因扩增与DNA测序：病毒DNA提取采用天泽基因工程有限公司生产的病毒DNA 提取试剂，HBV RT基因扩增采用我们建立的巢式PCR方法[8]。第二轮后扩增片段长度为819bp，包含了HBV RT基因中与耐药相关的B、C、D、E四个结构域。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化后，用ABI3730xl基因分析仪进行DNA序列测定，每个样品均进行正、反双向测序反应。


　　3．基因型分析：根据扩增的RT基因中所包含的S基因序列，用Virusblast和Mega-4软件进行分析。


　　4. HBV DNA载量测定：由我院临床检验中心完成，采用实时荧光定量PCR法，试剂由上海复星公司生产，检出下限值为500拷贝/ml（100IU/ml）。


　　5. 突变结果分析：对rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt214、rt215、rt217、rt233、rt236和rt250等12个位点的序列峰图依次进行分析，对正、反双向的测序结果进行比较印证，当同一位点存在2种碱基且每种碱基达到20%比例时计为序列共存。分析不同核苷（酸）类似物使用情况患者的耐药相关突变情况及不同核苷（酸）类似物耐药的突变形式。

　　结  果

　　1．一般资料：共收集患者340例，男286例，女54例。HBsAg阳性，平均年龄（35.5±14.9）岁，其中161例患者正在接受核苷（酸）类似物拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定单一或联合治疗，112例患者未曾接受过核苷（酸）类似物治疗，67例患者用药信息不详。


　　2．受检患者HBV DNA分布及其与耐药相关基因突变检测成功率的关系：340例患者中有302例做了即时HBV DNA定量检测，对这些样本的病毒载量分布与测序成功率进行了分析，结果表明HBV DNA≥104拷贝/ml的测序成功率为99.4%（179/180），HBV DNA≥500 ～＜104拷贝/ml的样本测序成功率为94.1%（64/68），HBV DNA＜500拷贝/ml的样本测序成功率为55.6%（30/54）。用HBV标准品进行倍比稀释测试表明我们的方法检测下限可达50～100拷贝/ml。


　　3．基因型分析：在306例测序成功的样本中，C型占78.8%（241/306），B型占14.7%（45/306），D型占1.6%（5/306），未确定基因型的样本占4.9%（15/306）。


　　4．碱基突变的检测结果：根据文献报道，我们确定检测与拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替比夫定耐药明确相关的RT基因12个位点上的突变。每个位点上可以存在1种以上突变形式。结果在12个位点上均检测到了耐药相关突变，检出碱基替换形式19种，包括2种与耐药关系不明确突变形式；在12个位点上检出的碱基突变序列总数为164个，其中突变/未突变（野生）序列共存数为59个，占36.0%，反映了HBV在体内的准种变异特性；不同的突变序列共存8个，包括6个M204I/V突变序列共存、2个A181T/V/I突变序列共存（表1）。


　　5． 各种耐药相关突变和突变组合形式的检出结果：340例患者中，96例患者（28.2%）的样本在12个分析位点上检出各种形式的突变（表2）。根据测序结果，结合临床用药情况与各种突变形式引起的耐药特性进行分析，结果显示：（1）96例检出突变的患者中，63例患者（18.5%）检出拉米夫定耐药相关突变，10例（2.9%）检出阿德福韦耐药相关突变，8例（2.4%）检出恩替卡韦耐药相关突变，1例（0.3%）检出替比夫定耐药相关突变，14例（4.1%）不能明确与使用药物的关系。（2）拉米夫定耐药相关突变中，M204V通常伴随L180M突变，M204I多以单独出现为主，此2种突变形式最为常见；阿德福韦相关耐药中，以N236T±A181位碱基替换最常见；恩替卡韦耐药均发生在拉米夫定耐药基础上，以T184位点的碱基替换最为常见。（3）一些位点与耐药的关系尚需进一步明确，例如A181T、V214A可能与拉米夫定或阿德福韦两种药物相关，需结合临床病毒和生化指标的动态变化进行分析。（4）少数患者在未记录使用核苷（酸）类似物的情况下也可检出耐药相关突变。见表3。

　　讨  论

　　对于多位点HBV基因突变的检测，目前国外主要应用的方法有线性探针反向杂交法、DNA芯片法和DNA测序法。前两种方法的优点是操作简便，敏感性相对较高，但试剂价格昂贵，只能检测已知的突变位点。国内近来也正在发展检测HBV多位点突变的DNA芯片技术，但还处于研发阶段[9]。后一种方法的优点是获得的信息全面，可以发现新的耐药突变，但敏感性不高。我们通过技术改进，使敏感性较常规DNA序列测定方法提高了2～3个数量级，同时方法的特异性、重复性、检测动态范围也达到了较好水平，并可以同时分析患者的基因型。在我们的检测中，HBV DNA<500拷贝/ml的样本中有约半数可扩增出HBV RT基因，分析是因为这些受检患者服用核苷（酸）类似物后使病毒抑制，但仍含极低量的病毒未被清除。我们在此类样本中检出了多例耐药突变，有助于临床早期发现基因耐药。


　　在340例患者中，82例检出的耐药突变可以明确与药物使用的关系，其中拉米夫定耐药有63例（76.8%），这与拉米夫定使用时间长、耐药屏障低是相符的，拉米夫定耐药后对其他药物可产生影响。拉米夫定换用阿德福韦患者的耐药突变检出率远高于拉米夫定加用阿德福韦患者，提示后者用法优于前者；在拉米夫定换用恩替卡韦的患者中拉米夫定突变检出率较高，提示单用恩替卡韦对消除患者体内HBV拉米夫定耐药株的作用可能有限。在单用阿德福韦的患者中，阿德福韦耐药突变检出率为10.5%（4/38），而实际上临床常见阿德福韦治疗无效的患者中有一部分检测不到阿德福韦耐药突变，提示机体药代动力学等非病毒因素也是引起阿德福韦耐药的可能原因。另一个值得关注的问题是少数患者可以出现原发耐药突变（对这些样本均进行过复查，常以突变/未突变共存形式存在），因而耐药病毒株的扩散问题应引起重视，在服用和换用核苷（酸）类似物前如有条件应进行HBV多位点耐药突变检测。


　　我们还检出了3种特殊突变形式Q215H、Q215P和A181I，前2种可能与拉米夫定和阿德福韦耐药相关[10]，后1种因均伴有A181T/V突变，提示可能是一种新的阿德福韦耐药突变形式。鉴于我国乙型肝炎患者HBV基因序列的复杂性以及使用核苷（酸）类似物人数众多，增加检测样本量可能检测到新的突变形式，但最终确定耐药突变需具备以下证据：（1）与使用治疗药物有关；（2）临床上出现病毒反弹和（或）病情反复；（3）体外实验证明突变病毒对治疗药物的敏感性降低；（4）可能出现在多个病例；（5）停药后病毒有可能恢复为野生型[11]。目前对一些突变的临床意义尚存有争议，主要集中在阿德福韦耐药相关突变上，包括V84M、A181T、V214A、Q215S、I233V、N238D等[9]，这与阿德福韦使用剂量低（敏感性下降数倍即可引起临床耐药）以及目前尚无标准化的表型耐药测定方法有关。其中A181T突变比较特殊，除了可引起拉米夫定、阿德福韦、替比夫定的非典型耐药外，还影响S蛋白的表达分泌[12]。


　　我们的结果是横断面的，样本的采集也带有随机性，但所反映的临床用药情况更接近临床实际，不仅限于文献经常报道的几种常规形式，这在一定程度上反映了目前临床抗病毒治疗还不十分规范，这将不利于减少耐药突变的产生。应用HBV序列测定或其他方法进行多位点耐药突变检测，有助于及时发现病毒耐药，采取有效的干预措施，避免或减轻临床反跳引起的肝细胞再损伤。

无所谓呀

根草

学习了，谢谢。

战斗胜佛

ainbaby

说明什么呢？不能治，等等再治？是这样理解吧