新的治疗病毒感染策略

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1.2.3  磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(Phosphorodiamidate Morpholino Oligonucleotides,PMOs)  PMOs是非离子DNA类似物，首先应用在斑马鱼系统发育过程功能基因敲除研究中。其分子中核糖被吗啉代取缔并且磷酰二胺连接代替了磷酸二酯键，这种结构改变使得PMOs对核酶消化具有更强的抵抗力，同时带电荷更接近中性，后者可以降低其在细胞内与蛋白的非特异结合。吗啉代与靶序列形成碱基对，但其结合力弱于DNA类似物与RNA低聚体的结合，这迫使在反义抑制中使用稍长（如含25个碱基）的寡聚体来提高其与靶序列的结合力。PMO-RNA杂化链形成后并不是通过激活RNA酶H来抑制蛋白质的合成，而是与mRNA的5’非翻译区或起始密码区元件相竞争，抑制其进一步与核糖体的结合和读码，有时PMOs还会占领mRNA拼接识别位点，从而阻断了其蛋白翻译前必需的转录后修饰。最近有报道PMOs可用于校正β－球蛋白前mRNA的拼接错误，对其突变可能有治疗作用。

与未经修饰的AODNs相比，PMOs的细胞摄取率要低一些，为弥补这一不足可以将其与一些阳性肽载体共轭结合，如富含精氨酸的HIV-TAT或果蝇触角抑制肽序列。PMOs不带正负电荷，因此这样的结合并不会引起分子之间的相互作用。而ODNs的磷酸二酯键带有阴性氧原子，与肽类载体的结合会影响其稳定性。

1.3  序列和抗病毒设计策略  实际上获得能有效抗病毒的AODNs序列并不容易。在一系列靶向病毒基因编码或非编码区不同位点的AODNs中，理论上讲可通过病毒生命周期的很多关键环节抑制其复制，但实践中可能只有一至两种序列显示出抗病毒效果。原因可能为病毒对干扰序列具有校正能力，也可能是使用的AODNs并不能进入RNA基因组的二级折叠结构。通常情况下，为挑选出具有应用前景的反义药物进入临床试验，常经筛选20－50条反义核酸序列。

尽管不同长度的AODNs都可能起效，三代PMO中较理想的仍是含20个左右碱基的长度。ODN随长度增加其进入细胞内的难度会增大，与蛋白质非特异相互作用会增强。但是ODNs长度如小于20个碱基，其序列特异性及结合效率自然会降低。有趣的是，结合富精氨酸短肽会使两者都有改善。

PMOs不会介导RNA酶H的降解，而是通过封闭转录起始和延伸过程起作用，因此最有效的靶序列应是病毒mRNA的5’和3’非编码区 ,病毒和宿主调节Co-opts区。对一些病毒来说，针对固有核糖体进入部位（internal ribosomal entry site,IRES）的互补序列可能是很好的选择，因为诸如柯萨奇B3和HCV等RNA病毒没有5’甲基帽结构。在一些病毒，RNA环化构象对翻译过程相当重要，类似于真核生物中poly-A结合蛋白与poly-A尾的连接，针对登革热病毒3’端环化序列的PMOs可有效抑制其复制。病毒基因组的其他有效靶序列还有RNA－蛋白质相互作用部位，这些部位通常负责修正mRNA在亚细胞结构中的定位。例如HIV－1型病毒的TAT反式激活应答元件（TAR）和逆转录应答元件（RRE）可能是抑制其复制有效的靶序列，因为这两个序列与病毒感染潜伏阶段向复制阶段的转换有关，而这两个元件都是介导HIV RNA 亚细胞内分布和运输的RNA－蛋白质相互作用部位。

针对非编码区设计的缺点是可能促进病毒产生逃逸突变的固有特性，因为病毒RNA基因组产生错误倾向的频率更高。实际上，在体外SARS冠状病毒经过连续传代培养几乎对所有的PMOs都会产生逃逸突变，均伴有至少部分耐药现象。治疗中使用针对多个位点的PMOs可能避免或减少突变产生，效果虽然不能累加，但每种PMOs都可能对其他成份导致的逃逸突变株有效。如果结合后可诱导RNA酶降解，AODNs也可以选择编码区作为靶序列，如HIV的gap、pol、env等区域。

1.4  AODNs的抗病毒作用   AODNs被广泛研究用于干扰阻断感染人类的病毒的基因表达，如流感病毒、疱疹性口炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、肝炎病毒等。第一个经美国FDA批准的AODN类药物是Vitravene，其作用靶点为巨细胞病毒的IE2基因，1998年被批准用于治疗巨细胞病毒引起的视网膜炎。从那以后超过40种基于核酸药物开始了临床试验，包括用于肿瘤、心血管、糖尿病、血液系统疾病、感染性疾病等领域。用于HIV的反义抗病毒治疗受到了极大关注。Enzo Biochem研制了第一代药物HGTV，此后他们给HIV感染者移植了转基因造血干细胞，目的为持续表达反义RNA。第二代药物GEM91因剂量依赖性毒副作用而被停用。

柯萨奇B3病毒（CVB3）是感染性心肌炎的常见病原，我们观察了几种反义核酸治疗对它的抗病毒疗效。基于病毒RNA的顺式和反式作用翻译序列元件的突变分析，我们设计了7条针对病毒5’和3’非编码区的PS－ODNs序列，并在培养细胞内评价其对CVB3的抑制作用。其中针对病毒IRES、AUG起始密码子以及临近RNA基因组5’及3’的4条序列显示出良好的抗病毒活性。最有效的靶序列临近3’端非编码区的末端，这些结果已在鼠心肌炎模型中得到进一步验证。

最近有许多体外试验显示出三代AODNs对多种病毒具有持续抑制作用，这些病毒尚无有效的治疗办法。我们掌握的资料中，PMOs可使HeLa和HL-1心肌细胞中的柯萨奇病毒滴度降低3个对数值。给心肌炎鼠注射FITC标记的PMOs肽结合物，评价其抗病毒疗效的同时，我们已经应用荧光共聚焦显微镜观察其在体内的分布情况。在北美洲，西尼罗河病毒（WNV）感染具有较高死亡率。体外评价一组针对9个不同序列的PMOS肽结合物对WNV的抑制作用时，发现其可以不同程度抑制病毒复制，在给药浓度为5mm时效果最好的PMO可使病毒滴度降低近5个对数值，且同时无明显的细胞毒性。此外在SARS冠状病毒、马动脉炎病毒、登革热病毒均取得类似结果。

无所谓呀

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wutan9158

太长了没看完就眼花了